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背景 Background

 

《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》其中描述了遺傳毒性試驗方法有多種，根據(jù)試驗檢測的遺傳終點(diǎn)，可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據(jù)試驗系統(tǒng)，又可分為體內(nèi)試驗和體外試驗。

 

目前于沒有任何單一試驗方法能檢測出所有的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳毒性機(jī)制，因此，通常采用體外和體內(nèi)試驗組合的方法，以全面評估受試物的遺傳毒性風(fēng)險。[1]

 

其中推薦的兩種標(biāo)準(zhǔn)試驗組合，均提及到了細(xì)菌回復(fù)突變試驗，細(xì)菌回復(fù)突變試驗又稱Ames試驗（Bacterial Reverse Mutation Test)，是埃姆斯等人于1975年建立并不斷發(fā)展完善的用于檢測污染物致突變性的試驗[2]。

 

一般利用突變型鼠傷寒沙門氏菌株（TAl535、TAl538、TA98、TAl00、TAl537或TA97或TA97a）或大腸桿菌色氨酸缺陷型菌株（WP2 uvra/uvra[pKM101]/pKM101）并加入哺乳動物肝微粒體進(jìn)行體外試驗，檢查其再次發(fā)生突變的情況用于檢測化合物的致變性和遺傳毒性。

表1.Ames菌株類型表

表2.沙門氏菌基因型的突變檢測[2]

 

原理

 

該試驗采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株或大腸桿菌色氨酸缺陷型菌株，這些突變的菌株自身不能合成組氨酸或色氨酸，必須依賴外源性組氨酸/色氨酸才能生長，而在無組氨酸/色氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活。

 

假如有致突變物存在，致突變物可使菌株基因發(fā)生回復(fù)突變，由營養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化為野生型，使它在缺乏組氨酸/色氨酸的培養(yǎng)基上也能生長，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。原理如下圖1所示：

圖1.沙門氏菌致突變性的遺傳學(xué)評價方法[2]

 

試驗一般設(shè)計：平板制備

 

培養(yǎng)基

 

0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（L-組氨酸78mg，D-生物素122mg，加蒸餾水至1000mL）配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min，4℃保存。

 

頂層瓊脂培養(yǎng)基

 

取瓊脂粉1.2g、氯化鈉1.0g，加蒸餾水至200mL。配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實(shí)驗時，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。

 

Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E

 

一水合枸椽酸100g、磷酸氫二鉀500g、四水合磷酸氫銨鈉175g、七水合硫酸鎂10g加蒸餾水至1000mL。配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。4℃保存。

 

20%葡萄糖溶液

 

葡萄糖200g加蒸餾水至1000mL。配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。4℃保存

 

底層瓊脂培養(yǎng)基：

 

瓊脂粉7.5g、蒸餾水480mL、V-B培養(yǎng)基E10mL、20%葡萄糖溶液10mL。配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用總結(jié)就是把一個時間段的工作進(jìn)行一次全面系統(tǒng)的總檢查、總評價、總分析、總研究，并分析成績的不足，從而得出引以為戒的經(jīng)驗。

 

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

 

牛肉膏2.5g、胰胨5.0g、磷酸氫二鉀1.0g，加蒸餾水至500mL。配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。4℃保存。

 

鹽溶液

 

氯化鉀61.5g、六水合氯化鎂40.7g，加蒸餾水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。4℃保存。

 

0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

 

磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)2.965g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)29.015g，加蒸餾水至500mL。配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

 

S9混合液

 

肝S9100mL、鹽溶液20mL、滅菌蒸餾水380mL、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液500mL、輔酶II(NADP)4mmol、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mmol。配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配并保存于冰水浴中。

 

表3.生物學(xué)特性鑒定

 

目前市面上有多種試劑盒用于Ames試驗，相比傳統(tǒng)的試驗，試劑盒在培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo)S9制備、菌株鑒定、菌株培養(yǎng)等步驟能節(jié)約大量時間，試劑盒一般分平板摻入法和預(yù)培養(yǎng)平板摻入法，具體操作如下：

 

平板摻入法

 

a)準(zhǔn)備所需底層培養(yǎng)基平皿若干。

b)融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2mL，在45℃水浴中保溫。

c)在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測試菌株菌液0.1mL，混勻；加受試物0.05mL~0.2mL（一般加入0.1mL。需活化時另外再加入10%S9反應(yīng)混合液0.5mL），再混勻，然后迅速傾入底層培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)動平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。d)另做一陽性對照、溶劑對照和未處理對照。陽性對照不加受試物，只加標(biāo)準(zhǔn)誘變劑（即試劑盒陽性對照試劑，表4）；溶劑對照加除受試物和標(biāo)準(zhǔn)誘變劑以外的所有試劑，如溶DMSO等（光譜純或分析純）；未處理對照只在培養(yǎng)基上加菌液；其他方法同上。

 

預(yù)培養(yǎng)平板摻入法

 

預(yù)培養(yǎng)對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據(jù)情況確定是否進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在加入頂層瓊脂前，先進(jìn)行以下預(yù)培養(yǎng)步驟：在試驗中，將受試物（需活化時另加入10%S9反應(yīng)混合液）和菌液，在37℃中培養(yǎng)20min，或在30℃中培養(yǎng)30min，然后再加2mL頂層瓊脂，其他同上述平板摻入法。

表4.有和沒有 S9 代謝激活的陽性對照[2]

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] 《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，2018

 

[2]   Urvashi Vijay.Microbial Mutagenicity Assay: Ames Test ，Bio-protocol [J]Vol 8, Iss 06, Mar 20, 2018