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1. 實驗原理/概述

DiD（紅色熒光）是一類親脂性熒光染料家族，常用于標記細胞膜和疏水性組織。作為一類環(huán)境敏感型熒光染料，當(dāng)它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子結(jié)合時，其熒光強度顯著增強，為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術(shù)提供了一種便捷的工具。這里將介紹DiD（紅色熒光）標記外泌體被細胞攝入的實驗，具體操作步驟如下：

圖1 DiD細胞膜熒光探針紅色——C61H99ClN2O4化學(xué)式結(jié)構(gòu)

（查詢網(wǎng)址：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/DiD-perchlorate）

2. 實驗材料

1、樣本&耗材：細胞、共聚焦皿/含爬片的6孔板、1.5mL EP管、tip頭（10μL/200μL/1mL）

2、試劑：無血清細胞培養(yǎng)基、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、Hoechst 33342染液

3、設(shè)備：熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等

3. 實驗操作

3.1 實驗準備

1.細胞培養(yǎng)：將需要研究的細胞系（如腫瘤細胞、免疫細胞等）培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期備用。

2.外泌體制備與標記外泌體制備：收集細胞培養(yǎng)上清液，通過差速離心、超濾、密度梯度離心或者試劑盒提取等方法分離提取外泌體，具體方法可根據(jù)實驗需求和實驗室條件選擇。

3.DiD標記外泌體：按照DiD染料說明書，將適量的DiD染料與外泌體溶液混合，在37℃孵育4~6 h進行標記反應(yīng)，使DiD染料嵌入外泌體的脂質(zhì)膜中。標記完成后，通過超速離心或凝膠過濾等方法去除未結(jié)合的DiD染料，得到DiD標記的外泌體。

3.2 細胞處理

1.細胞接種：將狀態(tài)良好細胞以合適的密度接種到直徑20mm的共聚焦皿或含爬片的6孔板中，一般每孔接種細胞數(shù)為5×105~1×106個，根據(jù)細胞類型和實驗需求調(diào)整。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~24 h，使細胞貼壁生長。

2.DiD標記的外泌體和細胞共孵育：將DiD標記的外泌體用無血清培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，例如終濃度為50-200 μg/mL，具體濃度可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整。去除細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細胞2~3次后，加入含有DiD標記外泌體的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育。

3.攝取時間設(shè)置：根據(jù)實驗?zāi)康脑O(shè)置不同的攝取時間點，如4 h、8 h、12 h、24 h等。在每個時間點結(jié)束時，進行后續(xù)操作。

4.細胞固定：孵育結(jié)束后，吸出含有外泌體的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，每次5 min，以去除未被攝取的外泌體。然后加入4%多聚甲醛固定細胞15 min，固定完成后，再用PBS洗滌細胞2~3次。

5.細胞核染色：向細胞中加入適量的Hoechst 33342染液，室溫下孵育15 min，對細胞核進行染色。染色完成后，用PBS洗滌細胞3次，每次5 min，去除多余的Hoechst 33342染液。

6.熒光觀察與拍照：使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細胞，DiD標記的外泌體在合適的激發(fā)光下會發(fā)出紅色熒光，Hoechst 33342染核后細胞核呈藍色熒光。選擇合適的視野，拍攝細胞攝取外泌體的圖像，記錄不同時間點細胞攝取外泌體的情況。

3.3 結(jié)果顯示

圖2 外泌體進入細胞。BG:白光通道

Hoechst 33342熒光染料主要染色細胞核（Hoechst33342），而DiD與外泌體共孵育后，主要染色外泌體（DiD）。帶紅色熒光標記的外泌體與細胞共孵育后，可能會進入細胞質(zhì)（Overlay），主要現(xiàn)象在BG+DiD組中體現(xiàn)。若設(shè)置時間拍攝可通過帶熒光標記外泌體在胞質(zhì)的滯留的量判斷外泌體被細胞攝取的一個相對動態(tài)變化。

4. 注意事項

整個實驗過程要保持無菌操作，避免細胞污染。

DiD染料標記外泌體時，要嚴格按照說明書操作，確保標記效率和標記的穩(wěn)定性。

細胞接種密度和外泌體濃度的選擇要合適，過低或過高都可能影響實驗結(jié)果的觀察和分析。

在熒光觀察時，要注意選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長，避免熒光信號的干擾。

實驗應(yīng)設(shè)置對照組，如只加入未標記外泌體的細胞組和只加入DiD染料的細胞組，以排除非特異性染色和其他因素的影響。

DiD染料具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命，因此實驗過程中注意避光。