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溶瘤病毒能抗腫瘤很多人多少都能理解一些。細(xì)菌用于腫瘤治療，熟悉的朋友相對少很多。但實(shí)際上，腫瘤內(nèi)部是有細(xì)菌存在的，而且細(xì)菌并不是作為旁觀者無所作為，而是對腫瘤的發(fā)展、腫瘤微環(huán)境（TME）的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。當(dāng)然，細(xì)菌也有好壞之分，有的促瘤，有的則抑瘤。

 

活菌用于腫瘤免疫治療研究已有數(shù)十年?；罹闹委熖攸c(diǎn)有別于其它抗腫瘤藥物，比如可以選擇性靶向腫瘤組織、可以到達(dá)腫瘤深處、可實(shí)現(xiàn)指數(shù)級增長，并能重塑腫瘤微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)“冷腫瘤”向“熱腫瘤”的轉(zhuǎn)變。此外，細(xì)菌還可以進(jìn)行工程改造，優(yōu)化其抗腫瘤能力。

 

本文重點(diǎn)介紹下TME中細(xì)菌的特點(diǎn)、功能，在腫瘤進(jìn)展和抑制中的作用，及臨床在研活菌產(chǎn)品等。

 

腫瘤內(nèi)活菌-腫瘤相互作用

 

嚴(yán)格講，腫瘤內(nèi)細(xì)菌的起源還不清楚。有三個(gè)可能的途徑。一是器官內(nèi)的粘膜屏障在腫瘤形成過程中被破壞，使細(xì)菌得以進(jìn)入腫瘤。二是考慮到腫瘤內(nèi)的細(xì)菌與所在組織的細(xì)菌譜很相似，有可能在腫瘤產(chǎn)生之前，細(xì)菌已經(jīng)在組織中存在。三是通過口腔、胃腸道系統(tǒng)或其它部位進(jìn)入血液，隨血液移行，并最終從受損的脈管系統(tǒng)定植在腫瘤部位。

 

細(xì)菌促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生及進(jìn)展

 

細(xì)菌通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤形成和/或進(jìn)展。如下圖所示，細(xì)菌可以通過影響宿主細(xì)胞基因組穩(wěn)定性促進(jìn)腫瘤形成，如分泌小分子基因毒素，引起DNA破壞和突變。細(xì)菌的效應(yīng)分子和粘附素可激活促瘤信號通路。細(xì)菌還可以導(dǎo)致持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)，為腫瘤形成創(chuàng)造條件。此外，細(xì)菌還可以結(jié)合NK和T細(xì)胞表面的抑制性免疫檢查點(diǎn)受體。

 

 

細(xì)菌抑瘤機(jī)制

 

細(xì)菌發(fā)揮促瘤還是抑瘤作用，很大程度上取決于菌株類型，不同細(xì)菌的表現(xiàn)區(qū)別很大。如下表所示，當(dāng)胰腺癌中富含假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas,）、鏈霉菌（Streptomyces）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）時(shí)，患者往往具備較長的生存期。有趣的是，將胰腺癌長生存期個(gè)體內(nèi)的胃腸道菌群移植到其它小鼠后，同樣會(huì)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。間接說明，瘤內(nèi)細(xì)菌與胃腸道微生物之間有密切聯(lián)系。當(dāng)然，細(xì)菌增強(qiáng)免疫的機(jī)制很多，有的細(xì)菌可以激活T和NK細(xì)胞的STING通路，增加DC細(xì)胞的抗原遞呈。有的則可以增加CD8+T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中的浸潤。

 

還有一點(diǎn)比較有意思。腫瘤會(huì)不停的異常表達(dá)一些抗原，有些是正常組織表達(dá)，但腫瘤表達(dá)更高的抗原。有些則是正常組織壓根不表達(dá)，腫瘤特異性表達(dá)的抗原。瘤內(nèi)細(xì)菌會(huì)表達(dá)一些與腫瘤抗原表位相同的多肽，而且不只序列一樣，甚至結(jié)構(gòu)和構(gòu)象也相似。這就無形中增加了抗腫瘤免疫，因?yàn)橛行┽槍咕腃D8+T細(xì)胞，同樣會(huì)交叉殺傷腫瘤細(xì)胞。

 

有些細(xì)菌還會(huì)影響現(xiàn)有腫瘤治療藥物的藥效。比如胰腺癌患者中，瘤內(nèi)γ-變形桿菌通過表達(dá)胞苷脫氨酶使吉西他濱失活，降低該藥物的藥效。伴放線聚集桿菌也同樣會(huì)促進(jìn)吉西他濱耐藥。結(jié)腸癌患者中，瘤內(nèi)核梭桿菌通過選擇性下調(diào)miR-4802下游TLR-4-MYD88信號通路，誘導(dǎo)自噬，導(dǎo)致5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的耐藥。所以，臨床通過給予抗生素治療，抑制這些菌群的作用，會(huì)增強(qiáng)很多抗腫瘤藥物的治療效果。

 

 

 

活菌用于腫瘤的治療

 

了解完細(xì)菌的一些作用，再看下工業(yè)界如何利用天然活菌或者基因改造菌探索抗腫瘤應(yīng)用的。

 

細(xì)菌經(jīng)系統(tǒng)途徑給藥后，在血液及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中濃度較高，之后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)，被快速清除。但細(xì)菌也有其獨(dú)門絕技，可以選擇性靶向和定植在腫瘤中。如下圖所示，細(xì)菌可以通過血管，在腫瘤部位滲透到微環(huán)境中。但細(xì)菌的滲透不像其他分子，多以被動(dòng)擴(kuò)散為主。細(xì)菌是通過識別死亡腫瘤細(xì)胞釋放的分子，主動(dòng)趨化進(jìn)入腫瘤深處的。一旦在腫瘤定植后，細(xì)菌開始增殖。那細(xì)菌在非腫瘤組織也會(huì)增殖嗎？其實(shí)，很多細(xì)菌在腫瘤部位蓄積比例更高，以沙門氏菌為例，腫瘤和非腫瘤部位的比例是10000:1。其中一個(gè)原因是，腫瘤微環(huán)境是免疫抑制的，對細(xì)菌其實(shí)也是一種保護(hù)，有利于其生存。但細(xì)菌也不會(huì)無限繁殖，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)將其限制在一定范圍和區(qū)域。不過，如果機(jī)體中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞被耗竭，瘤內(nèi)細(xì)菌就會(huì)毫無約束的擴(kuò)散。

 

 

治療性細(xì)菌的作用機(jī)制

 

細(xì)菌可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。一是通過搶營養(yǎng)。無論腫瘤還是細(xì)菌，都是活體，都需要腫瘤微環(huán)境中的營養(yǎng)維持存活，細(xì)菌可以耗竭營養(yǎng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。另外，有些細(xì)菌如沙門氏菌，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬。還有些細(xì)菌鞭毛成分能直接通過激活TLR5，抑制腫瘤細(xì)胞生長。李斯特菌通過增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，產(chǎn)生直接細(xì)胞毒作用。

 

另外，細(xì)菌是可以進(jìn)行工程改造的。通過改造，可以讓細(xì)菌表達(dá)一些具有細(xì)胞毒類作用的分子，比如cytolysin A、listeriolysin O、FAS ligand、TRAIL、TNF、Tum-5等，可以直接抑制腫瘤生長。還有些改造思路也挺有意思，細(xì)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)入可以將前藥轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物的酶，比如將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶，可以降低化療藥物的毒性，增強(qiáng)腫瘤部位的選擇性殺傷。細(xì)菌在腫瘤內(nèi)的靶向定植其實(shí)為靶向遞送提供了很多發(fā)揮空間，除了剛才說的這些酶、配體，還可以攜帶其他影響腫瘤生長的元件，比如小RNA，又如一些抗血管（內(nèi)皮抑素等）因子，通過各種機(jī)制抑制腫瘤生長，甚至殺死腫瘤細(xì)胞。此外，還可以攜帶一些免疫調(diào)節(jié)分子，比如IL-18、IL-2、IL-15、CCL21等，增強(qiáng)NK或CD8+T細(xì)胞活性，通過免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤。最后，細(xì)菌還可以表達(dá)一些TAA（腫瘤相關(guān)抗原），增強(qiáng)免疫識別能力。細(xì)菌的可探索和改造的策略很多，不再一一贅述。

 

細(xì)菌治療腫瘤的臨床研究

 

分離的菌株

 

1891年，William Coley采用鏈球菌治療骨肉瘤，這是首次記載的將活菌用于腫瘤治療。不過，雖然看到腫瘤抑制效果，也有患者出現(xiàn)感染導(dǎo)致的死亡。后來，Coley開發(fā)了粘質(zhì)沙雷氏菌和化膿性鏈球菌混合物，經(jīng)加熱滅活后，給予腫瘤患者，稱為“Coley toxin”，患者生存期得以延長（8.9年vs 7.0年），但藥效只能說是中等。另外一個(gè)采用細(xì)菌產(chǎn)品治療腫瘤的成功案例就是減毒的BCG（卡介菌，一種牛分枝桿菌）用于治療非肌層浸潤性膀胱癌，于1990年獲FDA批準(zhǔn)上市。

 

進(jìn)入2000年以后，腫瘤治療細(xì)菌產(chǎn)品的臨床研究逐漸增多。

 

鼠傷寒沙門氏菌VNP20009治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，雖然看到菌血癥的DLT反應(yīng)，但總體安全性表現(xiàn)尚可，可惜的是雖然看到一些促炎因子的釋放及細(xì)菌的腫瘤定植跡象，但未見腫瘤出現(xiàn)緩解。

 

2023年披露的一項(xiàng)編碼IL-2的鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)品，與FLOFIRINOX（奧沙利鉑、鹽酸伊立替康、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣化療組合）聯(lián)用治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌，20例患者的中位總生存期明顯延長，是歷史對照數(shù)據(jù)的2倍（24個(gè)月vs11.1或13.1個(gè)月）。

 

C. novyi-NT是一款減毒的諾維氏梭狀芽胞桿菌，不表達(dá)alpha毒素，可以在腫瘤內(nèi)的厭氧環(huán)境中復(fù)制。動(dòng)物試驗(yàn)中可看到裂解腫瘤細(xì)胞和引起炎癥反應(yīng)的作用。臨床Ⅰ期研究中，瘤內(nèi)注射，治療晚期實(shí)體瘤，24例患者中，42%患者看到腫瘤裂解和腫瘤負(fù)荷降低。2例患者出現(xiàn)4級膿毒癥，1例患者出現(xiàn)4級氣性壞疽的DLT。目前正在開展與PD-1抗體pembrolizumab聯(lián)用的Ⅰ期試驗(yàn)（NCT03435952），首例入組的患者已經(jīng)看到緩解。

 

李斯特菌也是臨床研究比較多的活菌之一。一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究，CRS-207（一款分泌間皮素的改造的李斯特菌）與胰腺癌疫苗GVAX和環(huán)磷酰胺聯(lián)用可延長94例經(jīng)治轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的生存期，且毒性較小。另外一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究，在CRS207+GVAX+環(huán)磷酰胺組合基礎(chǔ)上，加上PD-1抗體nivolumab，93例轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者，腫瘤微環(huán)境可看到CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓系細(xì)胞減少。不過，與不加nivolumab相比，并未見客觀緩解率和生存期的改善。CRS-207與培美曲塞和順鉑聯(lián)用治療惡性胸膜間皮瘤的Ⅰb期臨床試驗(yàn)，也看到了腫瘤內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增、CD8+T/Treg比例增加，DC和NK細(xì)胞浸潤增加，免疫抑制性M2巨噬細(xì)胞向M1轉(zhuǎn)化，但Ⅱ期臨床未見明顯獲益。ADXS-HPV也是一款改造的李斯特菌，可以分泌融合TAA（HPV16的E7抗原肽）的LLO，在一項(xiàng)宮頸癌Ⅱ期臨床中看到了不錯(cuò)的耐受性和有效率。后續(xù)啟動(dòng)了與化放療聯(lián)用治療高風(fēng)險(xiǎn)局部晚期宮頸癌Ⅲ期臨床試驗(yàn)。不過試驗(yàn)已經(jīng)終止，原因不明。ADXS-502是一株表達(dá)22種NSCLC相關(guān)抗原的李斯特菌，與pembrolizumab聯(lián)用，在鱗狀和非鱗NSCLC中看到了46%-67%的疾病控制率。JNJ-6404757也是一款表達(dá)間皮素的李斯特菌，Ⅰ期臨床與nivolumab聯(lián)用，大部分毒性表現(xiàn)為輕微發(fā)熱和寒戰(zhàn)，另有2/12例患者出現(xiàn)致命的肺炎。后續(xù)未見該產(chǎn)品開展進(jìn)一步臨床研究。

 

可以看到，大部分活菌抗腫瘤產(chǎn)品臨床主要與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用。主要原因是細(xì)菌可通過遞送TAA或免疫調(diào)節(jié)劑，幫助重塑腫瘤微環(huán)境。不過，目前臨床數(shù)據(jù)大多還源自早期臨床，更大樣本量的研究還在進(jìn)行中。

 

糞便移植（Faecal microbiota transplantation, FMT）

 

糞便移植咋一聽不怎么雅觀，或者有些離奇。但實(shí)際上，胃腸道微生物菌群可以影響腫瘤患者的免疫反應(yīng)，并作為免疫治療的一種方案正在開展臨床研究。FMT是一組混合菌群，移植后會(huì)出現(xiàn)優(yōu)勢菌群。腸道微生物組分析顯示，對FMT移植有應(yīng)答的黑色素瘤患者，移植后體內(nèi)富集程度最高的是厚壁菌門和放線菌門，擬桿菌門減少。FMT目前沒有太多積極的臨床數(shù)據(jù)披露。

 

FMT也有很多局限性，包括安全性問題，及因供體/受體等菌群標(biāo)準(zhǔn)化挑戰(zhàn)帶來的應(yīng)用受限，廣泛推廣和普適性有難度。為克服這一問題，有團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種有健康人糞便樣本純化得到的由30種不同細(xì)菌組成的菌群，Microbial Ecosystem Therapeutic 4（MET4），作為腸道微生物菌群移植的替代物。臨床數(shù)據(jù)顯示，MET4與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用治療晚期實(shí)體瘤，觀察到比免疫檢查點(diǎn)單藥更好的藥效。FMT在研臨床試驗(yàn)及結(jié)果如下表所示。

 

 

最后

 

抗腫瘤藥物的形式非常多樣。細(xì)菌這類活體其實(shí)在腫瘤治療方面的探索已經(jīng)100多年。雖然一度進(jìn)展緩慢，但2000年以后臨床研究逐漸增多。目前雖然上市的活菌類產(chǎn)品很少，但臨床試驗(yàn)卻是很多，主要是與PD-1抗體聯(lián)用?；罹惍a(chǎn)品面臨的主要挑戰(zhàn)也很多，一是作用機(jī)制不清晰，更多的是對免疫的多方面影響，如果能確定主導(dǎo)機(jī)制，會(huì)更有利于這類產(chǎn)品的開發(fā)。二是不良反應(yīng)比較多。即使是減毒的細(xì)菌，依然不可避免出現(xiàn)一些毒性反應(yīng)，比如感染，尤其是與免疫抑制化療藥物聯(lián)用，這一風(fēng)險(xiǎn)更高。三是活菌類藥物的藥代動(dòng)力學(xué)與其它傳統(tǒng)治療藥物很不同。活菌類藥物的有效性取決于在靶部位的增殖，而不是給藥劑量。四是活菌類藥物不能通過傳統(tǒng)的加熱或過濾手段去除不想要的病原體，這就為GMP臨床批樣品的生產(chǎn)帶來很大挑戰(zhàn)。作為一種新型活的生物體類治療藥物，還有很多來自監(jiān)管的挑戰(zhàn)，需要跟監(jiān)管機(jī)構(gòu)就樣品的生產(chǎn)、質(zhì)控、非臨床研究等進(jìn)行密切溝通。