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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2025-03-07 16:17
基于對(duì)過(guò)氧化氫滅菌技術(shù)的探討,本文對(duì)目前主流技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比分析,并將其應(yīng)用于肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗生產(chǎn)的潔凈室空間滅菌。通過(guò)將 VHP 滅菌過(guò)程與空調(diào)系統(tǒng)整合,實(shí)現(xiàn)了操作的便捷性與驗(yàn)證的可行性,滿足了用戶(hù)對(duì)于高頻率、短滅菌周期的需求。本文為制藥行業(yè)潔凈空間滅菌提供了具體的應(yīng)用案例。
過(guò)氧化氫(Hydrogen Peroxide),化學(xué)式為 H2O2,其水溶液通常被稱(chēng)為雙氧水,是一種強(qiáng)氧化劑。常用的使用濃度為 30% 或 35%,它能夠有效殺滅細(xì)菌、病毒、真菌以及芽孢,因此被認(rèn)為是一種廣譜殺菌劑。由于過(guò)氧化氫分解后產(chǎn)生的副產(chǎn)品完全無(wú)害,它在制藥潔凈室、食品、醫(yī)療和化工行業(yè)的滅菌應(yīng)用中被廣泛采納。目前,過(guò)氧化氫被認(rèn)為是世界上最理想的殺菌劑之一。
1.過(guò)氧化氫的滅菌機(jī)理
目前,過(guò)氧化氫滅菌技術(shù)主要分為 4 種:包括水溶液過(guò)氧化氫(AHP:Aqueous Hydrogen Peroxide)、 氣化過(guò)氧化氫(VHP: Vaporized Hydrogen Peroxide)、過(guò)氧化氫等離子體(HPP:Hydrogen Peroxide Plasma)以及過(guò)氧化氫汽霧(HPV :Hydrogen Peroxide Vapor)。在這些方法中,氣化過(guò)氧化氫(VHP)以其常溫、高濃度和干燥的特性,成為一種快速且高效的滅菌方式。
過(guò)氧化氫的殺菌機(jī)理[1-8]涉及兩種自由基:超氧自由基 O2- 和羥基自由基 OH-。這些自由基能夠破壞蛋白質(zhì)、多糖和 DNA。被氧化的堿基會(huì)被 DNA 修復(fù)機(jī)制識(shí)別并切割,導(dǎo)致DNA分子單鏈斷裂。隨著暴露時(shí)間和過(guò)氧化氫水溶液濃度的增加,斷裂的數(shù)量也會(huì)相應(yīng)增加。對(duì)于蛋白質(zhì)而言,過(guò)氧化氫具有顯著的降解作用。在液相中,蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng);而在氣相中,蛋白質(zhì)會(huì)被分解為更小的肽,從而達(dá)到更佳的滅菌效果。
綜合來(lái)看,過(guò)氧化氫的滅菌機(jī)理主要分為兩大類(lèi):
● 過(guò)氧化氫能夠破壞微生物的外層保護(hù)結(jié)構(gòu),使保護(hù)層的滲透性發(fā)生變化,進(jìn)而引起滲透壓的改變。這種破壞導(dǎo)致微生物細(xì)胞內(nèi)外平衡系統(tǒng)受損,最終導(dǎo)致微生物的死亡;
● 過(guò)氧化氫通過(guò)破壞微生物的酶、蛋白質(zhì)和 DNA,從而達(dá)到殺死微生物的目的。
2.氣態(tài)過(guò)氧化氫滅菌技術(shù)的最新發(fā)展及現(xiàn)狀
液態(tài)過(guò)氧化氫的殺菌效能已在一個(gè)多世紀(jì)前得到證實(shí),但它使用后產(chǎn)生的大量殘留物需要額外處理。氣態(tài)過(guò)氧化氫的殺菌原理大約在 1980 年代初期被提出。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[9],相較于嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子,氣化過(guò)氧化氫對(duì)枯草芽孢桿菌亞種孢子的殺滅效果更為顯著。
目前,氣態(tài)過(guò)氧化氫滅菌技術(shù)在歐美國(guó)家已成為生物凈化的關(guān)鍵技術(shù)之一。美國(guó) STERIS(思泰瑞)所代表的干法 VHP 滅菌和英國(guó)BIOQUELL(貝爾科)公司所代表的濕法噴霧滅菌 HPV 是其中的兩大主流方法。國(guó)內(nèi)外針對(duì)這兩種方法已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究和比較[10],結(jié)果匯總?cè)绫? 所示。

表1 HPV與VHP技術(shù)及效果對(duì)比表
BIOQUELL HPV 和 STERIS VHP的技術(shù)步驟對(duì)比見(jiàn)表2,兩者工藝步驟基本相同,主要差異在與對(duì)環(huán)境條件的要求以及過(guò)氧化氫的形態(tài)。

表2 BIOQUELL HPV和STERIS VHP的操作工藝對(duì)比
表3 展示了過(guò)氧化氫在液態(tài)與氣態(tài)兩種狀態(tài)下的滅菌效果對(duì)比。

表3 液相過(guò)氧化氫與氣相過(guò)氧化氫滅菌效果對(duì)比
研究顯示:在確保達(dá)到相同滅菌效果的條件下,氣態(tài)過(guò)氧化氫的滅菌時(shí)間比液態(tài)的要短;同時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)氣態(tài)過(guò)氧化氫的濃度在750~2000ppm時(shí),其滅菌效果與30000ppm過(guò)氧化氫液體相當(dāng),因此,氣態(tài)過(guò)氧化氫的滅菌效果更高。
3.氣態(tài)過(guò)氧化氫滅菌效果評(píng)估
3.1 滅菌目標(biāo)
滅菌是指殺滅細(xì)菌及其細(xì)菌繁殖體、芽孢、病毒和真菌孢子等所有微生物形態(tài)的過(guò)程。在制藥行業(yè),通常采用國(guó)際公認(rèn)的無(wú)菌保證水平(Sterility Assurance Level,SAL)來(lái)評(píng)估滅菌工藝的效果。SAL 定義為產(chǎn)品經(jīng)過(guò)滅菌處理后,微生物殘存的概率。SAL 值越低,產(chǎn)品中微生物存在的可能性就越小。因此,國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)通常規(guī)定,采用濕熱滅菌柜的 SAL 值不得超過(guò) 10-6,即滅菌后微生物存活的概率不得超過(guò) 1%。
根據(jù)消毒規(guī)范技術(shù)要求,滅菌目標(biāo)設(shè)定為生物指示劑(BIs)達(dá)到 106的殺菌率。常用的生物指示劑(BIs)包括黑色枯草芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌。
3.2 氣化VHP設(shè)備布局
VHP 發(fā)生器的送風(fēng)管道與被滅菌區(qū)域的潔凈空調(diào)系統(tǒng)送風(fēng)管道相連。通過(guò)被滅菌區(qū)域的潔凈送風(fēng)管道,將氣化的過(guò)氧化氫送入被滅菌的潔凈室,隨后通過(guò)被滅菌區(qū)域的回風(fēng)管道返回空調(diào)機(jī)組,實(shí)現(xiàn)循環(huán)通風(fēng)滅菌。這一過(guò)程確保氣化的過(guò)氧化氫能夠均勻地?cái)U(kuò)散至所有被滅菌區(qū)域。
3.3 測(cè)試試劑的準(zhǔn)備
在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前,確保所有必須的測(cè)試試劑和方案都已經(jīng)準(zhǔn)備就緒是非常重要的。測(cè)試試劑需要按照實(shí)驗(yàn)要求的純度和濃度進(jìn)行準(zhǔn)備,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
● 實(shí)驗(yàn)菌株:選用枯草桿菌黑色變種和嗜熱脂肪芽孢桿菌;
● 染菌載體:包括不銹鋼片和聚四氟乙烯墊片等,染菌量控制在1~5×106cfu/載體;
● 培養(yǎng)基:采用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB),確保使用前經(jīng)過(guò)濕熱滅菌處理;
● 布點(diǎn)策略:確保每個(gè)房間均布點(diǎn)采樣,選擇遠(yuǎn)離 VHP 發(fā)生器的區(qū)域,以及距離房間回風(fēng)口較遠(yuǎn)的位置,作為評(píng)估滅菌效果的關(guān)鍵點(diǎn)。
3.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[11]
滅菌合格標(biāo)準(zhǔn):實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的回收菌量應(yīng)為 1~5×106 cfu/ 載體,陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)有菌生長(zhǎng);陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng);實(shí)驗(yàn)組應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
4.氣化過(guò)氧化氫空間滅菌在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用
2023 年,筆者有幸參與國(guó)內(nèi)某疫苗企業(yè)新建的肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗車(chē)間項(xiàng)目,該項(xiàng)目的生產(chǎn)核心區(qū)域包括菌種制備間、Ps 發(fā)酵初純間、Ps 純化間、rPly 發(fā)酵初純間、rPly 純化間、緩沖液配制間、培養(yǎng)基配制間、CIP 站、凍干室以及制劑區(qū)等。在生產(chǎn)過(guò)程中,原料和中間體會(huì)頻繁進(jìn)出生產(chǎn)區(qū)域,因此,迫切需要一種高效且可靠的滅菌方法,以對(duì)物料表面、設(shè)備表面及空間進(jìn)行徹底滅菌,同時(shí),為了提高效率,還需要在最短時(shí)間內(nèi)完成物料的轉(zhuǎn)移。
針對(duì)本項(xiàng)目的工藝特點(diǎn),項(xiàng)目面臨三個(gè)主要挑戰(zhàn):
● 滅菌頻率高,需盡可能縮短滅菌操作周期;
● 盡量減少滅菌過(guò)程對(duì)潔凈室環(huán)境的影響;
● 確保人員安全,以及排氣對(duì)環(huán)境無(wú)害?;谶@些考量,項(xiàng)目最終決定采用固定式氣化過(guò)氧化氫裝置與潔凈室空調(diào)系統(tǒng)相結(jié)合的滅菌方案。
4.1 氣化過(guò)氧化氫裝置的構(gòu)成及工藝
4.1.1 氣化過(guò)氧化氫設(shè)備系統(tǒng)的構(gòu)成
氣化過(guò)氧化氫設(shè)備由過(guò)氧化氫發(fā)生器、除濕裝置、控制裝置以及管道閥門(mén)系統(tǒng)組成。設(shè)備主體包括柜體、送風(fēng)機(jī)、儲(chǔ)液罐、注射泵、預(yù)加熱器和蒸發(fā)器。控制系統(tǒng)由 Siemens PLC控制系統(tǒng)、觸摸屏和打印機(jī)構(gòu)成,負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)、控制和輸出設(shè)備運(yùn)行數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)可獨(dú)立運(yùn)行,也可由潔凈空調(diào)系統(tǒng)控制運(yùn)行,控制系統(tǒng)的啟動(dòng)、停止和通風(fēng)循環(huán),以及收集數(shù)據(jù)和監(jiān)控VHP 系統(tǒng)的狀態(tài)。管道閥門(mén)系統(tǒng)由不銹鋼自控閥門(mén)、硅膠管道、CPVC 和不銹鋼風(fēng)管等構(gòu)成。
4.1.2 VHP設(shè)備系統(tǒng)的工藝流程
VHP 設(shè)備系統(tǒng)與潔凈空調(diào)系統(tǒng)的送風(fēng)管道相連,將濃度為 35% 的過(guò)氧化氫液體通過(guò) VHP 發(fā)生器閃蒸轉(zhuǎn)化為VHP 氣體。該氣體通過(guò)分配管道輸送到待滅菌區(qū)域的空調(diào)送風(fēng)管道中,通過(guò)潔凈室房間頂部的 HEPA 過(guò)濾器均勻分布在各被滅菌區(qū)域,保持恒定濃度并維持一定時(shí)間,配合空調(diào)系統(tǒng)的循環(huán)運(yùn)行,對(duì)潔凈區(qū)的空間、設(shè)備、物料表面進(jìn)行有效滅菌。
4.1.3 氣化VHP裝置的運(yùn)行過(guò)程
第一步,除濕:降低空間的相對(duì)濕度,以滿足氣化過(guò)氧化氫滅菌所需的濕度條件。對(duì)于潔凈區(qū),將濕度控制在 60% 以下,符合潔凈區(qū)日常管理的潔凈等級(jí)濕度要求。在此階段,VHP 發(fā)生器連接到潔凈空調(diào)系統(tǒng)風(fēng)管上的閥門(mén)保持關(guān)閉狀態(tài),確保潔凈系統(tǒng)正常運(yùn)行。
第二步,調(diào)節(jié):調(diào)整過(guò)氧化氫的注射速率,快速提升 VHP 的濃度。
首先關(guān)閉潔凈空調(diào)系統(tǒng)的新風(fēng)閥和排風(fēng)閥,停止?jié)崈艨照{(diào)系統(tǒng)的冷凍水和加熱介質(zhì)供應(yīng),將空調(diào)系統(tǒng)送風(fēng)管至各房間的空氣調(diào)節(jié)閥調(diào)至全開(kāi)狀態(tài),同時(shí)將 VHP 發(fā)生器送風(fēng)管道至空調(diào)系統(tǒng)連接之間的閥門(mén)也調(diào)至全開(kāi)。啟動(dòng) VHP 發(fā)生器,將氣化的過(guò)氧化氫送入空調(diào)系統(tǒng),并通過(guò)房間的 HEPA高效過(guò)濾器送風(fēng)口將 VHP 傳輸至被滅菌的潔凈區(qū)域。此階段應(yīng)保持整個(gè)空調(diào)系統(tǒng)的相對(duì)濕度約為 55%。
第三步,滅菌:在維持一定 VHP濃度的情況下,對(duì)整個(gè)空調(diào)系統(tǒng)的風(fēng)管、房間、設(shè)備進(jìn)行滅菌處理。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的運(yùn)行后,即可實(shí)現(xiàn)滅菌效果。
第四步,通風(fēng):滅菌完成后,關(guān)閉 VHP 設(shè)備及送風(fēng)管道上的閥門(mén)。開(kāi)啟空調(diào)系統(tǒng)的新風(fēng),進(jìn)行全面排風(fēng),快速降低被滅菌區(qū)域的 VHP 濃度,使殘余的過(guò)氧化氫通過(guò)排放管道上的催化降解裝置后排至室外。當(dāng)潔凈區(qū)空間的過(guò)氧化氫濃度降至低于 1ppm 時(shí),通風(fēng)過(guò)程結(jié)束,潔凈空調(diào)系統(tǒng)恢復(fù)到正常運(yùn)行模式。
4.1.4 滅菌參數(shù)的設(shè)置
滅菌參數(shù)的設(shè)置是確保滅菌過(guò)程有效性的關(guān)鍵步驟,需要根據(jù) VHP 設(shè)備的特性及被滅菌物品的特性來(lái)精確設(shè)定。
● VHP 滅菌濃度設(shè)定為 650 mg/m3;
● 房間溫度維持在 24~26 ℃ ;
● 房間濕度≤ 55% ;
● 房間換氣次數(shù)> 15 次 /h。
4.2 氣化過(guò)氧化氫滅菌的潔凈室維護(hù)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)[12]
潔凈室圍護(hù)結(jié)構(gòu)的密封性對(duì) VHP的滅菌效果具有顯著影響。若空間的濕度控制(包括溫度和濕度的控制)不當(dāng),可能會(huì)導(dǎo)致液態(tài)過(guò)氧化氫冷凝液的形成,進(jìn)而對(duì)圍護(hù)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生腐蝕作用。
4.2.1 彩鋼板
該肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗項(xiàng)目的潔凈室圍護(hù)結(jié)構(gòu)采用了 50 mm 厚的夾芯金屬系列彩鋼板。
● 墻板彩鋼板:采用手工雙玻鎂巖棉夾芯,外層為 0.5 mm 厚的灰白色 PVDF 彩涂鋼板(雙面),內(nèi)層粘接5 mm 厚的玻鎂板,兩層玻鎂板之間填充巖棉,巖棉的容重為 120 kg/m³ 以上。所有承插面和密封面需涂滿粘合劑,以確?;迮c芯材之間的粘結(jié)牢固,無(wú)空鼓、脫層和斷裂線現(xiàn)象。彩鋼板的四周使用 0.8 mm 厚的鍍鋅鋼邊框,并采用厚墻體彈片結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定;
● 吊頂用彩鋼板:在潔凈室一側(cè)彩涂 PVDF,在技術(shù)夾層一側(cè)彩涂 PE 聚酯。彩鋼板成品覆膜上應(yīng)明確標(biāo)識(shí)涂層信息。吊頂用彩鋼板的其他加工要求與墻板彩鋼板相同。
所有彩鋼板的安裝縫隙應(yīng)保持均勻(2~3 mm),清潔后用密封膠雙面密封。用于潔凈室內(nèi)所有表面嵌縫的彈性密封材料為 798 食品級(jí)中性硅酮密封膠。
4.2.2 地面
采用抗腐蝕性能強(qiáng),耐磨性好以及達(dá)到 A 級(jí)防火標(biāo)準(zhǔn)的聚氨酯彩砂材料,厚度為4~5 mm。
4.2.3 面板門(mén)
選用密胺樹(shù)脂面板門(mén),其表面光滑細(xì)膩。門(mén)板厚度為 50 mm,采用鋁蜂窩作為門(mén)板夾芯材料。門(mén)上配備雙層透明玻璃觀察窗,玻璃內(nèi)充填惰性氣體,采用 5 mm 厚的鋼化玻璃,確保玻璃表面與彩鋼板表面平齊。邊框處使用密封膠進(jìn)行密封處理;門(mén)的四周采用連續(xù)的中空硅膠密封條,無(wú)卷邊、脫槽、缺口或斷裂問(wèn)題,且該密封條能承受 VHP 的侵蝕。
4.3 VHP滅菌的潔凈室空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)
在現(xiàn)代潔凈室的設(shè)計(jì)中,VHP 滅菌技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)重要的組成部分。潔凈室圍護(hù)結(jié)構(gòu)及空調(diào)系統(tǒng)必須考慮到 VHP 滅菌技術(shù)的特殊要求,以確保其完整性及滅菌效果。
4.3.1 VHP設(shè)備系統(tǒng)與潔凈室空調(diào)系統(tǒng)結(jié)合
將 VHP 設(shè)備系統(tǒng)與潔凈室空調(diào)系統(tǒng)相結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)更為高效和精確的滅菌效果。這種結(jié)合方式的流程示意圖如圖1 所示,它詳細(xì)展示了如何將 VHP 滅菌技術(shù)融入到潔凈室的空調(diào)系統(tǒng)中,以確保整個(gè)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。

圖1 VHP設(shè)備系統(tǒng)與空調(diào)系統(tǒng)的流程示意圖
4.3.2 VHP氣體注入風(fēng)管的方式
VHP 送風(fēng)管道垂直插入潔凈室空調(diào)送風(fēng)管,出口與氣流方向一致,參見(jiàn)圖2。

圖2 VHP送風(fēng)管道與潔凈空調(diào)布置示意圖
4.3.3 空調(diào)系統(tǒng)的材料選型
在設(shè)計(jì)和構(gòu)建空調(diào)系統(tǒng)的過(guò)程中,空調(diào)系統(tǒng)的材料選型不僅僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的選擇過(guò)程,而是一個(gè)需要綜合考慮多種因素的復(fù)雜決策。它涉及到對(duì)各種不同材料的性能、成本、耐久性以及環(huán)境影響等多方面因素的綜合考量。正確的選型可以確保系統(tǒng)的高效運(yùn)行,延長(zhǎng)使用壽命,同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的不良影響。
● 空調(diào)系統(tǒng)的送風(fēng)、回風(fēng)、排風(fēng)管道均采用 304 不銹鋼材質(zhì),通過(guò)折邊壓制工藝制成,確保了風(fēng)管的強(qiáng)度和耐久性。不銹鋼板的厚度控制在0.5 mm;
● 潔凈室頂部的高效過(guò)濾器靜壓箱同樣采用 304 不銹鋼板制作,而HEPA 過(guò)濾器則配置了鋁合金邊框。靜壓箱與過(guò)濾器箱體的所有連接處均采用滿焊技術(shù)進(jìn)行焊接,以確保密封性和結(jié)構(gòu)的完整性。過(guò)濾介質(zhì)選用的是玻璃纖維。HEPA 濾料與邊框的密封采用聚氨酯材料,而液槽密封則使用了果凍膠(硅膠);
● 對(duì)于暴露于 VHP 氣流中的所有AHU 空調(diào)機(jī)箱構(gòu)件,均采用能夠耐受VHP的特殊材料進(jìn)行制造。
4.4 VHP設(shè)備系統(tǒng)的日常運(yùn)行及維護(hù)
為了保障 VHP 設(shè)備系統(tǒng)的高效運(yùn)作,需要對(duì)設(shè)備進(jìn)行定期的檢查和必要的保養(yǎng)。
● 設(shè)備管理部門(mén)應(yīng)根據(jù)制造商的指導(dǎo)和實(shí)際使用經(jīng)驗(yàn),制定日常運(yùn)行的 SOP,定期維護(hù)的 SOP 以及保養(yǎng)計(jì)劃,并針對(duì)那些特別容易發(fā)生故障的部件,做好備件庫(kù)存;
● 所有的儀表應(yīng)納入計(jì)量管理計(jì)劃,以確保其計(jì)量的準(zhǔn)確性;
● 制定操作和維護(hù)人員的崗位培訓(xùn)計(jì)劃。
5.結(jié) 論
在探討過(guò)氧化氫滅菌技術(shù)的基礎(chǔ)上,本文對(duì)目前主流技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比分析,并將其應(yīng)用于肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗生產(chǎn)的潔凈室空間滅菌。將VHP 滅菌的整個(gè)過(guò)程與空調(diào)系統(tǒng)相結(jié)合,展現(xiàn)了其操作性和可驗(yàn)證性,能夠滿足用戶(hù)對(duì)高頻率、短滅菌周期的需求。這為制藥行業(yè)潔凈空間滅菌提供了具體的應(yīng)用案例。
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本文作者成中山,杭州萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司,僅供交流學(xué)習(xí)。

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