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1. 實(shí)驗(yàn)原理

電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic Mobility Shift Assay法，簡(jiǎn)稱(chēng)EMSA）是一種用于檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA或RNA之間相互作用的技術(shù)。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)可以確定特定的蛋白質(zhì)是否能夠結(jié)合到目標(biāo)DNA或RNA序列，并且可以進(jìn)一步研究這些相互作用的特性，如特異性、親和力以及影響因素等。

 

圖片來(lái)源：https://images.app.goo.gl/HZtMtbT3T4WwQWQAA

 

2. 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 試劑

標(biāo)記探針：生物素（Biotin）或放射性（如γ-32P）標(biāo)記的雙鏈DNA探針（例如NF-κB結(jié)合位點(diǎn)：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'）。

結(jié)合緩沖液：10 mM HEPES (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA, 5%甘油，0.1% NP-40。

競(jìng)爭(zhēng)性探針：100×過(guò)量未標(biāo)記野生型或突變型探針。

非變性聚丙烯酰胺凝膠：6%丙烯酰胺（29:1丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺），0.5×TBE緩沖液。

 

2.2 儀器與耗材

垂直電泳槽（如Bio-Rad Mini-PROTEAN系統(tǒng)）

轉(zhuǎn)膜裝置（若使用生物素標(biāo)記）

化學(xué)發(fā)光成像儀（如GE Amersham Imager 600）

預(yù)冷離心機(jī)、微量移液器、硅烷化EP管

 

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 探針制備與標(biāo)記

雙鏈探針退火：

合成互補(bǔ)單鏈DNA（各10 μM），95℃加熱5 min，緩慢冷卻至室溫。

生物素標(biāo)記：使用Biotin 3' End DNA Labeling Kit（Thermo Fisher）進(jìn)行末端標(biāo)記。

 

3.2 蛋白-DNA結(jié)合反應(yīng)

反應(yīng)體系（20 μL）：

標(biāo)記探針：1 μL（終濃度10 nM）

核蛋白提取物：5 μg（推薦BCA法測(cè)定濃度）

結(jié)合緩沖液：10 μL

Poly(dI-dC)：1 μL（1 μg/μL，抑制非特異性結(jié)合）

競(jìng)爭(zhēng)性探針（可選）：1 μL（100×過(guò)量）

孵育條件：室溫（25℃）避光孵育20 min。

 

3.3 非變性凝膠電泳

制膠：配制6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（厚度1 mm），預(yù)電泳30 min（100 V，4℃）。

上樣：加入10 μL結(jié)合反應(yīng)液與2 μL 6×Loading Buffer（含甘油）。

電泳條件：4℃下100 V電泳1.5-2 h（溴酚藍(lán)遷移至膠底端）。

 

3.4 轉(zhuǎn)膜與檢測(cè)（生物素標(biāo)記）

轉(zhuǎn)膜：將凝膠轉(zhuǎn)至尼龍膜（0.45 μm），380 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min。

交聯(lián)：UV交聯(lián)120 mJ/cm²。

顯色：

鏈霉親和素-HRP孵育30 min。

化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯影，成像分析。

圖片來(lái)源：https://en.wikipedia.org/wiki/Electrophoretic_mobility_shift_assay

 

4. 注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題

4.1 關(guān)鍵操作規(guī)范

探針設(shè)計(jì)：避免探針內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，推薦使用在線工具（如IDT OligoAnalyzer）驗(yàn)證。

蛋白活性：核提取物需分裝保存于-80℃，避免反復(fù)凍融（活性下降>50%需棄用）。

溫度控制：結(jié)合反應(yīng)與電泳需在低溫（4℃）下進(jìn)行，防止復(fù)合物解離。

 

4.2 常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

 

參考文獻(xiàn)：

Hellman, L. M. & Fried, M. G. (2007). "Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for Detecting Protein-Nucleic Acid Interactions". Nature Protocols.

 

Thermo Fisher Scientific (2021). Biotin 3' End DNA Labeling Kit Protocol.

 

Carey, J. & Smale, S. T. (2000). Electrophoretic Mobility Shift Assay. Cold Spring Harbor Protocols.

 

Bradford, M. M. (1976). "A Rapid and Sensitive Method for Protein Quantitation". Analytical Biochemistry.