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細(xì)菌回復(fù)突變試驗，是由Ames及其同事最早報道的，故又稱Ames試驗，用于評估潛在致突變或可能的致癌性。Ames試驗結(jié)果陽性，通常會假定待測物具有致癌作用，并可能導(dǎo)致候選藥物開發(fā)的終止。因此，致突變陽性、陰性的判定對于受試物的開發(fā)、監(jiān)管機構(gòu)評審、藥物上市等均會產(chǎn)生影響。有多種途徑可用于Ames數(shù)據(jù)評估，用的比較多的是倍數(shù)原則，比如≥平行設(shè)置的未經(jīng)受試物處理組的2倍。另外，雖然沒有普遍認(rèn)可的統(tǒng)一的統(tǒng)計方法，但統(tǒng)計學(xué)方法也是其中一條路徑，通常以p≤0.05計。即≥2倍或p≤0.05認(rèn)為受試物具有致突變性或潛在致癌性。那么，這種思路究竟有沒有問題呢？

 

先看下Ames試驗的背景。該試驗是由Ames等人在1973年開發(fā)的，后續(xù)又有其它團(tuán)隊做過優(yōu)化。簡言之，Ames試驗采用基因工程改造的含DNA突變的鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌進(jìn)行研究，并分為添加或不添加S9的兩種體系。S9是嚙齒類動物肝臟代謝系統(tǒng)，常用的是大鼠肝臟勻漿物。加S9的原因是很多化合物經(jīng)肝臟代謝后的代謝產(chǎn)物依然有生物活性，而細(xì)菌不具備代謝能力。Ames的基本原理是基因突變的沙門氏菌和大腸桿菌分別缺少組氨酸、色氨酸合成能力，在缺少這類氨基酸的培養(yǎng)基中無法存活，如果受試物引起基因突變，使以上菌株恢復(fù)組氨酸或色氨酸合成能力，則細(xì)菌正常生長，以此判斷受試物的致突變風(fēng)險。常用的菌株有5種，沙門氏菌TA98、TA100、TA1535、TA97/TA1537二選一、TA102或一株大腸桿菌菌株WP2uvrA/WP2uvrA pKM101。選擇這些菌株的原因是它們具有不同的突變類型、可以檢測不同DNA區(qū)域的敏感性、模擬不同DNA修復(fù)能力等，盡量增加檢測的廣度和深度，提高試驗的覆蓋面。

 

試驗通常將1*108細(xì)菌暴露在受試物下，設(shè)置加或不加S9兩種條件。按照OECD要求，除溶劑和陽性對照外，受試物至少需要設(shè)置5個劑量，劑量范圍跨越3個數(shù)量級。每個劑量設(shè)置三復(fù)孔，突變菌落數(shù)量取均值。溶劑對照作為突變的背景值，該數(shù)值視不同菌株、加/不加S9、不同濃度或不同實驗室操作，可能會有所差異。試驗結(jié)果方面，5個菌株中，任意菌株陽性，均認(rèn)為受試物具有致突變風(fēng)險。反之，如果受試物被視為無致突變風(fēng)險，則需要在OECD指定的5種菌株中均進(jìn)行過測試，且結(jié)果都是陰性。

 

陽性結(jié)果的定義

 

陽性的界定是Ames試驗的關(guān)鍵。在任何具備分裂能力的細(xì)胞和生物體中，都會存在天然突變。所以，Ames試驗中設(shè)置的溶媒對照（受試物劑量為零），背景突變也不是零，這一數(shù)值因菌株或其他因素所致也會有差異。問題的關(guān)鍵是超過平行設(shè)置的溶媒對照多少才視為陽性。

 

1979年，美國國家毒理學(xué)計劃遺傳毒性測試項目指出無論受試物組菌落數(shù)較對照組增加幾倍，必須要有可重現(xiàn)的，劑量相關(guān)性增加。

 

OECD 471（1983a）對結(jié)果的評價和解釋部分指出有幾個標(biāo)準(zhǔn)可用于陽性結(jié)果判定，比如受試物菌落數(shù)出現(xiàn)濃度相關(guān)增加和/或在至少1個菌株（加或不加代謝活化系統(tǒng)）的1個或多個濃度的每皿菌落數(shù)的增加可重現(xiàn)。應(yīng)首先考慮結(jié)果的生物學(xué)相關(guān)性（biological relevance）。統(tǒng)計學(xué)方法可以作為輔助手段，但不能作為判定陽性的唯一手段。OECD 472（1983b）中有過一致描述。

 

OECD 針對該指南的1997和2020版本指出“there is no requirement for verification of a clear positive response”，對生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)的描述與之前一致。但是，指南中并未給出clear positive或biological relevance的定義，也沒有提供判斷反應(yīng)是陽性、陰性還是不確定結(jié)果的具體指導(dǎo)或建議。

 

NMPA 2018年《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，至少在一個菌株上，在有或無代謝活化條件下，受試物所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)濃度依賴性的增加和/或在一個或多個濃度上出現(xiàn)可重復(fù)性的增加，可判定為陽性結(jié)果。結(jié)果判定時應(yīng)首先考慮試驗結(jié)果的生物學(xué)意義，統(tǒng)計學(xué)分析有助于結(jié)果的評價。

 

如果判定生物學(xué)反應(yīng)是供試品相關(guān)的，即陽性，該反應(yīng)應(yīng)該是與受試物濃度和/或暴露持續(xù)時間相關(guān)，并具備可重現(xiàn)性。某些情況下，還需要結(jié)合專家判斷、受試系統(tǒng)的生物學(xué)特點等綜合判定。

 

大部分Ames試驗在區(qū)分致突變和非致突變方面是沒有問題的，即明確陽性（clearly positive）、明確陰性（clearly negative）。前者可以明確看到濃度依賴性的突變增加，并超過平行設(shè)置的溶媒對照，且不需要統(tǒng)計學(xué)或進(jìn)一步計算；后者突變數(shù)量與溶媒對照一樣，且沒有濃度依賴性的增加。如下圖化合物A（陽性）和B（陰性）所示。這種類型的陽性和陰性判斷稱之為“inter-ocular rule”，即肉眼可見的判斷，不需要統(tǒng)計也不需要其它形式的分析。

然而，總有些化合物Ames結(jié)果的陰性和陽性不是那么明顯。突變增加的不多，且增加的趨勢也不是那么單一，如果下圖化合物C，低濃度不怎么增加，高濃度略有增加。按照2倍規(guī)則、3倍規(guī)則或者不同統(tǒng)計學(xué)處理，會得出不同的結(jié)論，可能最終結(jié)果就是“不確定”。

 

傳統(tǒng)常見的陽性判斷方法包括倍數(shù)法、ANOVA、95%置信區(qū)間、Bernstein模型。前文中的化合物A，無論采用哪種方法，都能得出陽性結(jié)論?；衔顱則相反，無論哪種方法都是陰性。化合物C采用ANOVA或其他統(tǒng)計方法，陽性。采用2倍的倍數(shù)規(guī)則，則是陰性。95%置信區(qū)間法，高劑量落在了平行設(shè)置的溶媒對照之外，但可能落在了實驗室歷史溶媒對照的背景數(shù)據(jù)以內(nèi)?；衔顲面臨的命運是，如果按照ANOVA或者Berstein模型，則該化合物具有致突變風(fēng)險，可能會停止開發(fā)。如果按照2倍規(guī)則，則致突變陰性，有可能繼續(xù)推進(jìn)至臨床階段。

 

當(dāng)下使用的判斷標(biāo)準(zhǔn)和路徑

 

大致分為5種情況：2倍或優(yōu)化的2倍規(guī)則；統(tǒng)計學(xué)方法；超過歷史對照范圍；專家判斷；以上多種方法聯(lián)合使用。

 

倍數(shù)法

 

2倍或優(yōu)化的2倍規(guī)則是目前使用最廣泛，也是非常簡便、容易操作的方法。最早源于1975年細(xì)菌回復(fù)突變發(fā)明人Ames團(tuán)隊，認(rèn)為小于2倍的增加視為陰性。陽性結(jié)果或不確定結(jié)果需要進(jìn)行確認(rèn)，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系。但該實驗室并未給出陽性反應(yīng)的cut off值。

 

后續(xù)逐漸發(fā)現(xiàn)，對于某些菌株如TA1535、TA1537等的背景突變數(shù)量只有20或不到，2倍的背景計數(shù)視為陽性，不夠保守。Dunkel等人1984年對這一規(guī)則進(jìn)行了修訂，認(rèn)為對于低背景突變的菌株，超過2.5或3倍背景值方認(rèn)為是陽性，并被廣泛接受和使用。

 

不過，倍數(shù)法具體怎么操作未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。是1個濃度超過2倍或3倍即視為陽性還是至少需要2個濃度達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)？突變數(shù)量的增加需要有劑量相關(guān)性嗎？三復(fù)孔之間的變異度（SD或SEM）需要考慮嗎？沒有達(dá)到2倍或3倍，但有明顯的劑量相關(guān)增加趨勢是視為陰性還是不確定？

 

另外，這種嚴(yán)格的倍數(shù)規(guī)則，屬于劃一條線，過線即陽性，忽視了皿與皿之間的差異。可能會出現(xiàn)下表之中的情況，不同皿之間的溶媒對照計數(shù)略有差異，按照嚴(yán)格2倍規(guī)則計算，就會對結(jié)論造成影響?；衔顱如果溶媒對照與化合物A一致，則致突變結(jié)果可能就是陰性或不確定。

 

統(tǒng)計學(xué)

 

統(tǒng)計學(xué)方法有一點與倍數(shù)規(guī)則法類似，都是通過劃一條線，過線即陽性。只不過統(tǒng)計學(xué)是通過p值來定義顯著和非顯著性區(qū)分陽性、陰性。當(dāng)然，倍數(shù)法更容易操作和計算。不過，正如倍數(shù)法是人為設(shè)定的規(guī)則，沒有內(nèi)在生物學(xué)意義一樣，統(tǒng)計學(xué)方法計算的本質(zhì)是認(rèn)為二者沒有差異的可能性小于1/20（以p≤0.05為例）。p=0.052和p=0.049，從統(tǒng)計學(xué)角度會給出一個化合物陰性、陽性的結(jié)論，但其實二者之間沒有生物學(xué)意義的差異，很可能是皿間變異引起。另外，采用不同統(tǒng)計學(xué)方法可以得出不同的結(jié)論，正如不同實驗室采用不同的倍數(shù)界定陽性、陰性一樣。目前為止，披露的統(tǒng)計學(xué)方法有很多，如Margolin et al., 1981;Myers et al., 1981; Stead et al., 1981; Bernstein et al., 1982; Snee & Irr,1984; Krewski et al., 1993; Mahon et al., 1989; Leroux & Krewski, 1993;Edler, 1992; Kim &Margolin, 1999。但是，都沒有得到廣泛使用。可能與倍數(shù)法更容易使用，不需要專業(yè)統(tǒng)計軟件有關(guān)，也可能與倍數(shù)法對于一些菌株如TA100、TA98更保守有關(guān)，亦或者與監(jiān)管機構(gòu)更熟悉倍數(shù)法有關(guān)。

 

超過歷史背景對照

 

除了滿足倍數(shù)規(guī)則或統(tǒng)計顯著性之外，建議陽性反應(yīng)應(yīng)該超出歷史背景對照范圍或者分布的上限，可以參考OECD 2014a No.473、OECD 2014a No.474、OECD 2017。歷史對照的上限可以根據(jù)95%置信區(qū)間確定，也可以采用2或3倍SD設(shè)定。

 

歷史對照也有其局限性，每個實驗室的菌株來源可能不同、S9批次不同、瓊脂和試劑的批號及用量不同、孵育溫度和時間不同、操作人員不同等均對克隆計數(shù)造成影響。盡管如此，相較于平行設(shè)置的溶媒對照，歷史對照似乎更受重視。但實際上，就具體試驗而言，平行開展的溶媒對照數(shù)據(jù)更相關(guān)。

 

所以，在評估Ames試驗結(jié)果時，歷史對照數(shù)據(jù)不應(yīng)該被賦予與同時對照同等或更高的權(quán)重，而應(yīng)該更多地作為評估試驗本身是否可接受的工具。

 

綜合以上方法

 

2019年，Levy等人提出可以將倍數(shù)法、統(tǒng)計學(xué)方法、歷史對照三種方法聯(lián)合使用。對于明確的陽性反應(yīng)，需要同時滿足以上三種標(biāo)準(zhǔn)。反之，陰性反應(yīng)，則三種方法均是陰性方可。其它情況，則視為可能陽性、可能陰性或不確定性。不過，這個方法并沒有達(dá)成共識。其實還是涉及到每種方法如何界定陽性、陰性的問題。

 

專家判斷

 

專家判斷的本質(zhì)是基于主觀的個人經(jīng)驗和偏見（based on the data reviewer's biases and experience）。但是專家判斷這種主觀方法也有一定的應(yīng)用場景，比如某些反應(yīng)相對較弱但可重復(fù)，且與濃度相關(guān)，但沒有達(dá)到一個令人信服的水平以將其定為致突變物，可以通過專家判斷是否應(yīng)該定為致突變的不確定結(jié)論。又比如某些化合物的致突變反應(yīng)僅限于單一濃度，或結(jié)果不可重復(fù)的情況。但是，即使同一個實驗室的不同人員對同樣數(shù)據(jù)也可能得出不同結(jié)論，更何況來自不同實驗室的人員。所以，陽性反應(yīng)的可重復(fù)性，專家盲審，可以增強結(jié)果的可信度和一致性。

 

Ames陽性判定方法討論

 

Ames遺傳毒性測試結(jié)果的重要性不言而喻，很多情況下能左右一個化合物的命運。但縱觀各種Ames陽性判定方法，很難界定哪些反應(yīng)是真正具有生物學(xué)意義的陽性反應(yīng)，哪些反應(yīng)雖然超過對照水平但并無實際意義。無論實驗室如何定義“生物學(xué)相關(guān)性”，都難以確定一個明確的界限來區(qū)分哪些反應(yīng)是真正具有生物學(xué)意義的陽性反應(yīng)。這也是Ames試驗的難點所在，雖然FDA和OECD均將生物學(xué)層面的相關(guān)性置于首位，但何謂生物學(xué)相關(guān)卻未給出明確定義。雖然大部分試驗結(jié)果不難判定，總有些試驗受試物菌落數(shù)增加但又達(dá)不到實驗室擬定的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，這時可能會有多種其它方法供選擇，而采用不同路徑得到的結(jié)果卻又不同。對于這類無法明確陽性或陰性的情況，最好對試驗進(jìn)行重復(fù)，或者采用相同方案，或者對試驗方法進(jìn)行改進(jìn)（如受試物濃度間距調(diào)整）。這點在ICH S2(R1)有過類似描述，“最理想的是試驗?zāi)艿玫矫鞔_的陽性或陰性結(jié)果。但是，試驗結(jié)果有時達(dá)不到預(yù)先設(shè)定的陽性或陰性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，因此被定為可疑或不確定。統(tǒng)計學(xué)方法的應(yīng)用有助于數(shù)據(jù)分析。但是，充分的生物學(xué)意義分析是至關(guān)重要的。對可疑結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗，可得到1）一個明確的陽性結(jié)果，因此總體結(jié)果為陽性；2）一個陰性結(jié)果，所以可疑結(jié)果缺乏重現(xiàn)性，總體結(jié)果為陰性；3）另一個可疑的結(jié)果，最后結(jié)論仍維持可疑。

 

Ames陽性的后續(xù)處理

 

ICH S2(R1)中指出，大量回顧研究顯示許多在Ames試驗中檢出為致突變劑的化合物是嚙齒類動物致癌劑。NMPA《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》也指出Ames試驗?zāi)軝z出相關(guān)的遺傳學(xué)改變和大部分嚙齒類動物和人類的遺傳毒性致癌劑。

 

以上兩個指南均提到，當(dāng)Ames試驗結(jié)果陽性時，提示受試物具有DNA反應(yīng)性，為評估患者用藥的潛在風(fēng)險，需進(jìn)行廣泛的追加試驗評價體內(nèi)致突變和致癌性潛力，除非通過適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險-獲益分析證明是合理的。另外，應(yīng)對陽性結(jié)果進(jìn)行分析，比如受試物純度，以確定陽性結(jié)果是否污染物所致。又如氨基酸污染也會導(dǎo)致菌落數(shù)升高，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以Ames試驗不適合檢測可能會降解的肽類。還有一種情況是陽性結(jié)果不具備人體遺傳毒性潛力，例如發(fā)生細(xì)菌特異性代謝（如通過細(xì)菌硝基還原酶活化）。

 

FDA提出，當(dāng)遺傳毒性結(jié)果為陽性時，對進(jìn)入臨床試驗是否安全，F(xiàn)DA會考慮所有的安全性資料。這些考慮包括對所有遺傳毒性資料的全面徹底的評價和擬進(jìn)行的臨床試驗的性質(zhì)。如果這些遺傳毒性試驗的結(jié)果提示無潛在的遺傳毒性，臨床研究一般可在健康受試者和擬用臨床適應(yīng)癥的病人中進(jìn)行。若出現(xiàn)明確的陽性結(jié)果，需要提供有關(guān)遺傳毒性機制的證據(jù)以及這種機制與預(yù)期體內(nèi)暴露的相關(guān)性，或者排除DNA作用機制。