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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2025-03-10 20:17
摘 要： 建立了基于鈍化碳量子點(diǎn)的熒光分光光度法測(cè)定護(hù)膚品中的谷胱甘肽含量。高溫加熱檸檬酸制備碳量子點(diǎn)溶液，將不同濃度的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液與1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺溶液（EDC）混合10 min，加入碳量子點(diǎn)溶液中反應(yīng)10 min。樣品用水提取，經(jīng)PBS磷酸鹽緩沖溶液稀釋后，與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同步操作，測(cè)定熒光強(qiáng)度。谷胱甘肽溶液的質(zhì)量濃度在0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，方法檢出限為0.004%。在3種基質(zhì)中，高、低兩種加標(biāo)水平下的平均回收率為93.7%～101.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.3%（n=6）。該方法操作簡(jiǎn)便，適用于護(hù)膚品中谷胱甘肽含量的快速檢測(cè)。
關(guān)鍵詞： 熒光分光光度法； 護(hù)膚品； 谷胱甘肽
近年來(lái)，隨著消費(fèi)者對(duì)健康重視程度的提升以及對(duì)護(hù)膚品成分關(guān)注度的增加，市場(chǎng)上對(duì)于多樣化、具有明確功效且見(jiàn)效迅速的護(hù)膚品需求日益增長(zhǎng)，這一趨勢(shì)也逐漸成為護(hù)膚品研發(fā)的核心方向［1］。肽類(lèi)是當(dāng)前廣受關(guān)注的功能性成分。這類(lèi)分子由蛋白質(zhì)片段構(gòu)成，通過(guò)脫水和聚合過(guò)程形成，并通過(guò)化學(xué)鍵（酰胺鍵）相互連接［2］。它們不僅具備調(diào)節(jié)生理狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)作用的能力，還對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育周期、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及內(nèi)分泌平衡等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3-5］。其中，谷胱甘肽是最早被應(yīng)用于護(hù)膚品的天然活性分子之一。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三個(gè)氨基酸組成的三肽化合物，其結(jié)構(gòu)內(nèi)含特殊的活性基團(tuán)，能夠有效地清除身體內(nèi)部自由基，從而起到抵抗氧化、改善皮膚顏色、淡化色斑及減緩衰老等功效［6-7］。
目前，谷胱甘肽的檢測(cè)方法主要有液相色譜法［8-12］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13-14］、毛細(xì)管電泳法［15-16］、電化學(xué)法［17-18］、熒光法［19-22］等，其中色譜、質(zhì)譜技術(shù)和熒光法應(yīng)用較為廣泛。目前對(duì)護(hù)膚品中谷胱甘肽的檢測(cè)大多用色譜、質(zhì)譜技術(shù)，其方法靈敏度較高，但對(duì)設(shè)備的要求也高。熒光法因其簡(jiǎn)便的操作流程、低廉的儀器成本、快速的反應(yīng)速度等優(yōu)點(diǎn)，一直是科研和工業(yè)領(lǐng)域廣泛關(guān)注的分析技術(shù)，但熒光法對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)研究一般集中于生物樣本（如血清等），應(yīng)用于護(hù)膚品的檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。研究［19］表明，高溫加熱檸檬酸得到的碳量子點(diǎn)通過(guò)1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的鈍化可提高其熒光強(qiáng)度。EDC分子被引入到碳量子點(diǎn)表面，促進(jìn)了表面能級(jí)的陷阱發(fā)射，從而增強(qiáng)了碳量子點(diǎn)的熒光性能。通過(guò)預(yù)先將谷胱甘肽與EDC溶液混合，谷胱甘肽與EDC結(jié)合后消耗部分EDC，剩余的EDC繼續(xù)參與鈍化碳量子點(diǎn)，導(dǎo)致碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。研究結(jié)果表明，谷胱甘肽的濃度與鈍化后碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度之間存在一定的線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)。筆者結(jié)合護(hù)膚品的基質(zhì)特點(diǎn)，首次應(yīng)用該原理建立了熒光分光光度法測(cè)定護(hù)膚品中谷胱甘肽含量。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，為企業(yè)原料控制、保障消費(fèi)者權(quán)益提供技術(shù)參考。
1. 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
熒光分光光度計(jì)：RF-6000型，日本島津公司。
電子分析天平： BSA224S型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。
旋渦振蕩器：Kylin-Bell VORTEX-5型，江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。
高溫爐：BF51866C-1型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
pH計(jì)：PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。
高速離心機(jī)：3-18KS型，德國(guó)希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司。
磁力攪拌器：MS7-H550-Pro型，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。
檸檬酸：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
PBS磷酸鹽緩沖溶液：0.01 mol/L，pH=7.0，上海源葉生物科技有限公司。
氫氧化鈉：分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
EDC溶液：稱(chēng)取適量EDC，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）溶解，配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的EDC溶液。
谷胱甘肽（還原型）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.9 %，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。
護(hù)膚品樣品：市售。
1.2 實(shí)驗(yàn)步驟
1.2.1 碳量子點(diǎn)溶液的制備
稱(chēng)取2.00 g（精確至0.01 g）檸檬酸于15 mL的帶蓋小燒杯中，將小燒杯放置在180 ℃高溫爐中加熱。40 min后，檸檬酸由固體變成淺黃色的液體，將小燒杯從高溫爐中取出，冷卻至室溫，此時(shí)小燒杯中的淺黃色液體凝固。向小燒杯中加入2 mL的100 mg/mL氫氧化鈉溶液，在磁力攪拌下完全溶解，再轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用100 mg/mL氫氧化鈉溶液定容，搖勻，得pH值為7的碳量子點(diǎn)溶液，待用。
1.2.2 溶液配制
稱(chēng)取谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50.0 mg于小燒杯中，加入PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，混勻，制備成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至10 mL容量瓶中，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.2.3 樣品前處理
稱(chēng)取護(hù)膚品樣品1.0 g（精確至0.001 g）于10 mL具塞比色管中，加入4 mL水和1 g氯化鈉，在旋渦振蕩器上旋渦振蕩30 s，用水定容至標(biāo)線，搖勻。4 000 r/min的條件下離心5 min。準(zhǔn)確移取1.0 mL上清液至10 mL具塞比色管，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）定容至10 mL，搖勻，制備得樣品溶液。
1.2.4 上機(jī)檢測(cè)的前處理
準(zhǔn)確移取5.0 mL PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）（對(duì)應(yīng)F0）、5.0 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（對(duì)應(yīng)F）、5.0 mL樣品溶液，各加入50 μL EDC溶液（50 mg/mL），在旋渦振蕩器上旋渦混勻10 min，各加入30 μL碳量子點(diǎn)溶液反應(yīng)10 min，待測(cè)。
1.2.5 儀器工作條件
激發(fā)光波長(zhǎng)為360 nm，激發(fā)與發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm，掃描速度為2 000 nm/min，在380～600 nm的范圍內(nèi)掃描記錄發(fā)射光譜。
1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
在1.2.5儀器工作條件下，記錄1.2.4中各溶液在發(fā)射波長(zhǎng)460 nm處的熒光強(qiáng)度，未加入標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)體系的熒光強(qiáng)度為F0，加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液后體系的熒光強(qiáng)度為F。以谷胱甘肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/F0為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
2. 結(jié)果與討論
2.1 反應(yīng)時(shí)間的選擇
準(zhǔn)確移取5.0 mL PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0），加入50 μL的50 mg/mL EDC溶液混勻，再加入30 μL碳量子點(diǎn)溶液，記錄不同反應(yīng)時(shí)間的熒光強(qiáng)度見(jiàn)圖1。由圖1可知，前10 min內(nèi)，熒光強(qiáng)度急劇升高；反應(yīng)10 min后，體系的熒光強(qiáng)度基本平穩(wěn)，說(shuō)明EDC與碳量子點(diǎn)反應(yīng)基本完成，所以選擇10 min為反應(yīng)時(shí)間。
圖1 不同反應(yīng)時(shí)間的熒光強(qiáng)度
Fig. 1 Effect of reaction time on fluorescence intensity
2.2 pH值的優(yōu)化
考察不同pH值條件下對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)溶液pH值小于7時(shí)，熒光強(qiáng)度較小；當(dāng)溶液pH值大于7時(shí)，熒光強(qiáng)度較大；在pH為7.0時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，表明此時(shí)EDC對(duì)碳量子點(diǎn)的鈍化作用最強(qiáng)，因此選擇pH值為7.0為實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)環(huán)境。為減小pH值波動(dòng)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的影響，選擇pH值為7.0的PBS磷酸鹽緩沖溶液作為配制谷胱甘肽和EDC的溶劑，同時(shí)在樣品前處理時(shí)用pH值為7.0的PBS磷酸鹽緩沖溶液作為稀釋液。
圖2 不同pH值下的熒光強(qiáng)度
Fig. 2 Fluorescence intensity at different pH values
2.3 共存物試驗(yàn)
考察護(hù)膚品中常見(jiàn)的共存物質(zhì)L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-肌肽、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、角鯊?fù)椤⒈窖跻掖肌?-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯和4-羥基苯甲酸丁酯對(duì)谷胱甘肽測(cè)定結(jié)果的影響，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）將上述物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的溶液，代替谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.4和1.2.5步驟操作，不同共存物質(zhì)下的F/F0值見(jiàn)圖3。由圖3可知，除谷胱甘肽之外，其他物質(zhì)的F/F0值均接近1.0，表明只有谷胱甘肽能夠消耗掉EDC，間接影響碳量子點(diǎn)的鈍化程度，使碳量子點(diǎn)顯示出不同的熒光強(qiáng)度，說(shuō)明該方法對(duì)于護(hù)膚品中谷胱甘肽的測(cè)定有較強(qiáng)的特異性。
1—空白；2—谷胱甘肽； 3—L-賴氨酸； 4—L-絲氨酸； 5—L-肌肽； 6—1，3-丙二醇； 7—1，2-丙二醇； 8—角鯊?fù)椋?9—苯氧乙醇； 10—4-羥基苯甲酸甲酯； 11—4-羥基苯甲酸乙酯； 12—4-羥基苯甲酸丙酯； 13—4-羥基苯甲酸丁酯圖3 不同共存物質(zhì)下的F/F0值
Fig. 3 F/F0 values under different coexisting substances
2.4 線性方程、檢出限和定量限
在1.2.5儀器工作條件下，按照1.2.6步驟建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。體系加入不同濃度的谷胱甘肽后的熒光光譜圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，體系在發(fā)射波長(zhǎng)460 nm處的熒光強(qiáng)度隨谷胱甘肽濃度的增大逐漸減小，且最大發(fā)射峰位置相同，均位于460 nm，記錄460 nm處的熒光強(qiáng)度F。
圖4 體系檢測(cè)不同濃度谷胱甘肽的熒光光譜圖
Fig. 4 Fluorescence spectra of the system to detect different concentrations of glutathione
谷胱甘肽的質(zhì)量濃度在0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)與F/F0呈線性關(guān)系，以谷胱甘肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、F/F0為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性方程為F/F0 = -0.004 3x+0.969 8，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4。其中F為不同濃度的谷胱甘肽與 EDC溶液（50 mg/mL）預(yù)混合反應(yīng)后加入碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為不含谷胱甘肽的體系熒光強(qiáng)度。連續(xù)測(cè)定11次不加入谷胱甘肽時(shí)體系在460 nm處的熒光強(qiáng)度，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與線性回歸方程斜率的比值計(jì)算得檢出限為0.4 μg/mL。由于方法在測(cè)試樣品時(shí)稱(chēng)取1 g樣品，經(jīng)1.2.3前處理后，上機(jī)測(cè)試時(shí)相當(dāng)于將樣品稀釋了100倍，因此方法檢出限為0.004%，以3倍的方法檢出限計(jì)算得方法定量限為0.012%。
2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)
分別選取水劑、膏霜和乳液3種代表性樣品進(jìn)行回收率與精密度試驗(yàn)。稱(chēng)取不含谷胱甘肽的樣品，分別添加高、低兩個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液到樣品中，分別做6次平行試驗(yàn)，回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表1。由表1可知，在三個(gè)濃度的加標(biāo)水平下，谷胱甘肽的平均回收率為93.7%～101.5%，6次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.3%，表明該方法精密度、準(zhǔn)確度均較高，可準(zhǔn)確測(cè)定護(hù)膚品中的谷胱甘肽含量。
表1 陰性樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 1 Negative sample spiking recovery test results
3. 結(jié)語(yǔ)
建立了基于鈍化碳量子點(diǎn)的熒光分光光度法測(cè)定護(hù)膚品中的谷胱甘肽含量。該方法線性范圍廣，精密度和準(zhǔn)確度良好，分析速度快，檢測(cè)成本低，為護(hù)膚品中谷胱甘肽的檢測(cè)提供有力的參考依據(jù)，可增強(qiáng)企業(yè)原材料的質(zhì)量管理和控制，確保消費(fèi)者的合法權(quán)益得到有效保護(hù)。
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來(lái)源：化學(xué)分析計(jì)量
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