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1. 實驗原理

 

細胞內(nèi)分泌實驗主要用于研究細胞分泌特定分子（如蛋白質(zhì)、激素等）的能力和機制。

 

本文以胰島β細胞為例，探討其在不同條件下的胰島素分泌情況。胰島素是由胰島β細胞合成并分泌的一種關鍵激素，調(diào)節(jié)血糖水平。通過模擬生理或病理狀態(tài)，可以評估不同因素對胰島素分泌的影響。

圖片來源：https://www.britannica.com/science/islets-of-Langerhans

 

以胰島β細胞為例，其胰島素分泌機制如下：

 

葡萄糖代謝觸發(fā)：葡萄糖通過GLUT2轉(zhuǎn)運體進入細胞，經(jīng)糖酵解和線粒體氧化磷酸化生成ATP。

離子通道調(diào)控：ATP/ADP比例升高關閉KATP通道，細胞去極化激活電壓依賴性Ca²?通道，Ca²?內(nèi)流觸發(fā)胰島素囊泡胞吐。

分泌檢測：通過ELISA、化學發(fā)光法或放射免疫分析（RIA）定量上清液中胰島素含量。

 

圖片來源：https://doi.org/10.3389/fcell.2017.00055

 

2. 實驗材料

 

2.1 細胞與試劑

 

1. 細胞系：INS-1 832/13細胞（大鼠胰島素瘤細胞，ATCC CRL-11471）或原代小鼠胰島細胞。

2. 培養(yǎng)基：

基礎培養(yǎng)基：RPMI 1640（Gibco, 11875-093）含11.1 mM葡萄糖，補充10% FBS（Gibco, 10099-141）、1 mM丙酮酸鈉、50 μM β-巰基乙醇。

Krebs-Ringer緩沖液（KRB）：129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 2.5 mM CaCl?, 1.2 mM MgSO?, 1.2 mM KH?PO?, 5 mM NaHCO?, 10 mM HEPES（pH 7.4），含0.1% BSA。

3. 刺激劑：

高糖KRB：含16.7 mM葡萄糖（Sigma, G8769）。

陽性對照：30 mM KCl（通過去極化直接激活Ca²?通道）。

檢測試劑：小鼠/大鼠胰島素ELISA試劑盒（Mercodia, 10-1247-01）。

 

2.2 儀器與耗材

 

細胞培養(yǎng)箱（37℃, 5% CO?）

24孔細胞培養(yǎng)板（Corning, 3524）

低溫離心機（4℃, 1000×g）

酶標儀（BioTek, Synergy H1）

 

3. 實驗步驟

 

3.1 細胞培養(yǎng)與預處理

 

1. 細胞復蘇與傳代：

 

INS-1細胞用含11.1 mM葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2-3天傳代（胰酶消化比例1:3）。

 

注意：細胞密度維持于70-80%匯合，傳代超過30代需更換新批次。

 

2. 饑餓處理：

 

實驗前夜，更換為低糖培養(yǎng)基（2.8 mM葡萄糖）培養(yǎng)12小時，同步細胞分泌狀態(tài)。

 

3.2 胰島素分泌實驗

 

1. 細胞鋪板：

 

消化細胞，調(diào)整密度至2×10? cells/mL，接種于24孔板（500 μL/孔），培養(yǎng)48小時至單層融合。

 

2. 刺激分泌：

 

洗滌：用預溫KRB緩沖液（2.8 mM葡萄糖）輕柔洗滌細胞3次。

分組處理（每孔加入1 mL KRB）：

陰性對照：2.8 mM葡萄糖。

實驗組：16.7 mM葡萄糖。

陽性對照：30 mM KCl（含2.8 mM葡萄糖）。

孵育：37℃、5% CO?孵育1小時。

 

3. 樣本收集：

 

吸取上清液，4℃ 1000×g離心5分鐘去除細胞碎片，-80℃保存待測。

細胞裂解：加入100 μL RIPA裂解液，BCA法測定總蛋白濃度（用于數(shù)據(jù)標準化）。

 

3.3 胰島素定量（ELISA法）

 

1. 標準品稀釋：按試劑盒說明配制0-200 μIU/mL標準曲線。

 

2. 檢測步驟：

 

加樣：50 μL標準品或樣本至預包被板孔，25℃孵育2小時。

洗滌：洗板5次。

加酶標二抗：100 μL/孔，25℃孵育1小時。

顯色：加入TMB底物100 μL/孔，避光反應15分鐘。

終止：50 μL 1M H?SO?，450 nm測吸光度。

 

3. 計算：

 

根據(jù)標準曲線計算胰島素濃度（μIU/mL），結(jié)果以“分泌量/總蛋白（μIU/mg）”表示。

 

4. 注意事項與常見問題

 

4.1 關鍵操作規(guī)范

 

1. 細胞狀態(tài)：原代胰島細胞需在分離后24小時內(nèi)使用，INS-1細胞傳代次數(shù)≤30。

 

2. 緩沖液溫度：KRB緩沖液需預溫至37℃，避免溫度應激影響分泌。

 

3. 樣本處理：上清液離心后立即分裝凍存，反復凍融導致胰島素降解。

 

4.2 常見問題與解決方案

 

參考文獻：

Rorsman, P. & Ashcroft, F. M. (2018). "Pancreatic β-Cell Electrical Activity and Insulin Secretion: Of Mice and Men". Physiological Reviews.

Mercodia AB (2022). Insulin ELISA Kit Product Manual.

Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 7th ed. Wiley-Blackwell.

Skelin, M. et al. (2010). "The Regulation of Insulin Secretion in Human Pancreatic Islets". Diabetes.