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近期，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院陳偉團(tuán)隊(duì)和中科院深圳先進(jìn)研究院潘浩波、崔旭團(tuán)隊(duì)貴州省人民醫(yī)院任有亮博士在科愛(ài)創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表文章：針對(duì)復(fù)雜植入物相關(guān)骨感染面臨的致病菌難清除、感染性骨破壞修復(fù)難度大、抗生素骨水泥藥物有效率低以及潛在組織毒性等問(wèn)題，本研究課題組將硼硅酸鹽生物活性玻璃（BSG）負(fù)載低劑量硫酸慶大霉素PMMA骨水泥用于植入物相關(guān)金葡菌骨感染研究。研究發(fā)現(xiàn)：BSG對(duì)細(xì)菌ATP合成具有明顯抑制作用，強(qiáng)化了極低GS劑量的殺菌效率與對(duì)金葡菌生物膜清除效用，同步實(shí)現(xiàn)了局部骨整合。這不但提升了抗生素有效利用率，還降低了抗生素所致細(xì)菌耐藥與毒性。

骨感染是臨床骨科災(zāi)難性并發(fā)癥之一。作為骨髓炎的標(biāo)準(zhǔn)療法，負(fù)載抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥對(duì)感染病灶中生物膜包裹的細(xì)菌殺傷能力極為有限。此外，高劑量抗生素植入物易造成細(xì)菌耐藥、全身系統(tǒng)性毒性和組織愈合受損等風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)將硼硅酸鹽生物活性玻璃（BSG）摻入低劑量硫酸慶大霉素（GS）負(fù)載的PMMA骨水泥中，提出了一種協(xié)同根除細(xì)菌并實(shí)現(xiàn)順序性骨整合的智能策略。結(jié)果表明，BSG摻入不僅保持了PMMA骨水泥的臨床使用性能，還賦予其離子和堿性微環(huán)境營(yíng)造特性。BSG降解所營(yíng)造的微環(huán)境可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和膜完整性，并通過(guò)抑制細(xì)胞膜上電子呼吸鏈抑制細(xì)菌ATP合成，同時(shí)削弱細(xì)菌抗氧化成分（過(guò)氧化物酶體和類胡蘿卜素），使胞內(nèi)活性氧（ROS）水平大幅提升。同時(shí)，BSG聯(lián)合GS自身抗菌機(jī)制（與核糖體的30S亞基結(jié)合，抑制翻譯過(guò)程），使細(xì)菌ATP合成抑制和氧化應(yīng)激加強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)低于GS臨床使用劑量下對(duì)骨感染病灶內(nèi)細(xì)菌殺滅和生物膜清除。此外，從PMMA植入物中釋放出的GS、生物活性離子以及構(gòu)建的局部弱堿性微環(huán)境，還可協(xié)同促進(jìn)hBMSCs成骨表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)感染微環(huán)境下局部骨整合與成骨再生。因此，本研究通過(guò)對(duì)PMMA中摻入BSG，提出一種可減少臨床抗生素劑量和提升植入物抗菌活性與成骨性能的治療復(fù)雜金葡菌骨感染策略。此策略有望有效解決細(xì)菌耐藥性、感染性骨缺損的修復(fù)難題。

圖1.（a）硼硅酸鹽生物活性玻璃和生物活性抗菌骨水泥的制備。EDS成像圖像顯示BSG在PMMA內(nèi)均勻分布。（b）將生物活性抗菌骨水泥植入感染性股骨髓腔實(shí)現(xiàn)抗菌與促成骨示意圖。（c）生物活性抗菌水泥的抗菌機(jī)制。（d）生物活性抗菌骨水泥的成骨效應(yīng)示意圖。

一．生物活性抗菌PMMA骨水泥的制備與表征

本研究采用熔融法制備了硼硅酸鹽生物活性玻璃（BSG），傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）與X射線衍射（XRD）顯示：BSG顆粒為非晶態(tài)硼氧和硅氧雙重網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在PMMA中摻入BSG后，PMMA固化過(guò)程溫度略降低。同時(shí)，骨水泥可操作時(shí)間符合外科植入物丙烯酸樹(shù)脂骨水泥的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 5833:2002）（不超過(guò)15分鐘）。由于BSG降解導(dǎo)致PMMA基材內(nèi)微孔增加，使摻入BSG的PMMA水泥機(jī)械性能輕微下降。值得注意的是，在浸泡過(guò)程中，B/G/PMMA組始終顯示更高 pH值、離子累積濃度和GS濃度，說(shuō)明BSG和GS能相互促進(jìn)各自從生物活性抗菌骨水泥的釋放。

圖 2.（a）BSG顆粒的SEM（白色標(biāo)尺=5μm；黑色標(biāo)尺=2μm）。（b）B/G/PMMA骨水泥的斷面微觀形貌（白色比例尺=50μm；黑色比例尺=20μm）和（c）B/G/PMMA骨水泥表面的EDS（比例尺=100μm）。骨水泥操作時(shí)間（d）、抗壓強(qiáng)度（e）和四點(diǎn)彎曲強(qiáng)度（f）。骨水泥在PBS浸泡不同時(shí)間后抗壓強(qiáng)度（g）和四點(diǎn)抗彎強(qiáng)度（h）的變化。骨水泥在PBS浸泡不同時(shí)間后，PBS的pH值變化曲線（i），（j）BO3³?的累積釋放，（k）Ca²?的累計(jì)釋放及（l）硫酸慶大霉素（GS）的累積釋放。

二．生物活性抗菌PMMA骨水泥體外抗菌性能評(píng)價(jià)

其次，本研究評(píng)估了生物活性抗菌骨水泥對(duì)金黃色葡萄球菌活性、生物膜形成、形態(tài)結(jié)果影響。結(jié)果表明，BSG的離子與堿性微環(huán)境，以及GS的釋放，能協(xié)同強(qiáng)化骨水泥的細(xì)菌殺傷和生物膜清除效應(yīng)。

圖3.（a）金黃色葡萄球菌菌落圖像和（b）定量分析。（c）使用Alamar Blue試劑（激發(fā)波長(zhǎng)：560 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：590 nm）檢測(cè)樣品表面培養(yǎng)6小時(shí)后檢測(cè)金黃色葡萄球菌的活性。（d）培養(yǎng)6小時(shí)后的金黃色葡萄球菌的活/死染色（比例尺=75μm）和（e）形態(tài)（比例尺=2μm）。

三．金黃色葡萄球菌與骨水泥共培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

為明確生物活性抗菌水泥的抑菌機(jī)制，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，RNA-Seq結(jié)果顯示，將生物活性抗菌水泥暴露于細(xì)菌環(huán)境后，生物活性抗菌水泥可立即部分釋放所負(fù)載的GS，并逐步營(yíng)造由BSG降解產(chǎn)生的離子和堿性微環(huán)境。細(xì)胞外高滲透離子環(huán)境首先可破壞細(xì)菌壁膜結(jié)構(gòu)完整性，同時(shí)堿性微環(huán)境隨后干擾細(xì)胞膜上呼吸鏈、破壞細(xì)菌ATP合成，有效降低細(xì)菌損傷耐受性，抑制細(xì)菌菌落發(fā)育及其生物膜形成。隨著細(xì)胞壁膜破壞加重，積聚在細(xì)胞外的GS大量進(jìn)入金黃色葡萄球菌胞內(nèi)，使細(xì)菌活性受到嚴(yán)重抑制，進(jìn)而發(fā)揮深層次抗菌作用。

圖 4. 火山圖顯示PMMA和B/PMMA組（a）間以及B/PMMA和B/G/PMMA組（B）之間的基因表達(dá)差異。（c）差異表達(dá)基因的維恩圖。（d）通過(guò)基因集富集分析（GSEA）分析PMMA和B/PMMA組之間金黃色葡萄球菌的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、膜組成部分和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。（e）使用京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）分析比較PMMA和B/PMMA組之間金黃色葡萄球菌的上調(diào)基因和（f）下調(diào)基因。（g）使用KEGG分析比較B/PMMA和B/g/PMMA組之間金黃色葡萄球菌的上調(diào)基因和（h）下調(diào)基因。（i-k）蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖顯示的生物過(guò)程間聯(lián)系。

圖5.（a）熱圖分析組間差異基因表達(dá)。通過(guò)蛋白質(zhì)濃度測(cè)試（b）和鄰硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）測(cè)定（c）檢測(cè)膜通透性。（d）生物膜結(jié)晶紫染色和（e）在562 nm下的定量分析。（f）595 nm處的ATP定量分析。（g）通過(guò)2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測(cè)活性氧（ROS）水平與其定量分析，激發(fā)波長(zhǎng)：480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm，比例尺=50μm。

四．hBMSCs與骨水泥共培養(yǎng)后成骨分化體外評(píng)價(jià)

本研究還發(fā)現(xiàn)BSG降解釋放的離子、堿性微環(huán)境及低濃度抗生素刺激也有利于hBMSCs的細(xì)胞活化，進(jìn)而顯著促進(jìn)了hBMSCs在體外存活、增殖和成骨分化，同時(shí)促進(jìn)早期（RUNX2）、中期（ALP）和晚期（OCN）成骨基因表達(dá)顯著上調(diào)，提示本研究所構(gòu)建生物活性抗菌PMMA骨水泥在完成初步抗菌任務(wù)后可以順序增強(qiáng)骨整合，且在體內(nèi)無(wú)任何生物毒性。

圖6.（a）共培養(yǎng)1天、3天和5天后hBMSCs的細(xì)胞毒性和增殖。（b）在24小時(shí)后hBMSCs的活/死（比例尺=200μm）和細(xì)胞骨架染色（比例尺=50μm）。（c）共培養(yǎng)模式示意圖。（d）hBMSCs的堿性磷酸酶（ALP）染色，比例尺=50μm。（e）培養(yǎng)7天后細(xì)胞培養(yǎng)基中ALP定量分析。（f）共培養(yǎng)14天后，hBMSCs的茜素紅S（ARS）染色，比例尺=50μm。（g）hBMSCs的ARS染色定量分析。在共培養(yǎng)7天后的（h）堿性磷酸酶（ALP）和（i）runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）基因表達(dá)。（j）在共培養(yǎng)14天后的骨鈣素（OCN）和骨橋蛋白（OPN）基因表達(dá)。（l）在共培養(yǎng)7天和14天后hBMSCs的RUNX2和OCN蛋白表達(dá)。

五．骨水泥抗菌活性、骨整合和生物相容性的體內(nèi)評(píng)價(jià)

為進(jìn)一步檢測(cè)所構(gòu)建生物活性抗菌水泥對(duì)植入物相關(guān)金葡菌骨感染的治療效果，本研究通過(guò)構(gòu)建植入物相關(guān)金葡菌骨感染模型，并植入不同性質(zhì)的植入物進(jìn)行治療，待感染形成1周和2周后，單純PMMA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金葡菌感染性股骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)大量菌落。與負(fù)載GS的PMMA水泥相比，摻入BSG的生物活性抗菌水泥治療組顯示出優(yōu)異抗菌活性。X射線顯示，PMMA骨水泥組表現(xiàn)出明顯骨感染和骨膜反應(yīng)，而B(niǎo)/G/PMMA組僅顯示出輕微骨膜反應(yīng)。組織學(xué)H&E染色顯示，除B/G/PMMA組外，PMMA、G/PMMA和B/PMMA組髓腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，革蘭氏染色進(jìn)一步證實(shí)，PMMA、G/PMMA和B/PMMA組可見(jiàn)大量金黃色葡萄球菌定植于骨細(xì)胞腔隙小管網(wǎng)絡(luò)（OLCN）和髓腔內(nèi)感染性死骨中。Masson染色證明，B/G/PMMA植入物周圍大量膠原蛋白形成。上述綜合證明，生物活性抗菌水泥具有優(yōu)異的抗菌作用，可清除定植在骨小管和死骨中金黃色葡萄球菌。植入后4周和8周，Micro-CT結(jié)果顯示，B/PMMA和B/G/PMMA植入物周圍的新骨形成明顯，形成殼結(jié)構(gòu)。G/PMMA骨水泥植入物周圍只觀察到一定量的松散和無(wú)定形骨組織，骨參數(shù)分析顯示，B/G/PMMA組新生骨量最高。

圖7.（a）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（b）植入后1周瓊脂平板法下菌落形成。（c）瓊脂平板法菌落定量分析。（d）使用細(xì)菌培養(yǎng)法（OD=600nm）評(píng)估植入后1周抗菌效果。（e）植入1周和2周后金黃色葡萄球菌感染的大鼠股骨病變X射線照片。（f）X射線評(píng)分直方圖。（g）植入2周后的蘇木精-伊紅（H&E）染色、（H）革蘭氏染色和（i）Masson染色。

圖8. （a）植入8周后大鼠股骨的矢狀面和三維重建圖像。（b）植入后8周骨參數(shù)分析，包括骨體積/總體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）。（c）植入4周后H&E染色、（d）革蘭氏染色和（E）Masson染色。比例尺=200μm。

總之，本研究將BSG負(fù)載于低劑量抗生素PMMA骨水泥，為有效解決植入物相關(guān)金黃色葡萄球菌骨感染所面臨的致病菌清除以及感染性骨缺損修復(fù)提供了一種極具前景的策略。研究發(fā)現(xiàn)：BSG的加入不僅維持了PMMA的優(yōu)良機(jī)械特性，還可提升PMMA骨水泥生物活性，使其抗菌性大幅改善。機(jī)制上，BSG降解損傷了細(xì)菌壁膜完整性，降低抗氧化組分（如類胡蘿卜素）活性，并阻礙細(xì)菌ATP合成。此外，BSG和低劑量GS還可協(xié)同促進(jìn)hBMSCs體內(nèi)外活性、粘附、增殖和成骨分化。本研究初步驗(yàn)證摻入了BSG的抗生素PMMA骨水泥對(duì)金葡菌骨感染的抗菌潛能及骨誘導(dǎo)特性，此研究成果可為進(jìn)一步解決臨床難治性金葡菌骨感染所面臨的病原菌清除和感染性骨缺損修復(fù)等問(wèn)題提供重要參考。

原文信息

Fan M, Ren Y, Zhu Y, Zhang H, Li S, Liu C, Lv H, Chu L, Hou Z, Zhang Y, Pan H, Cui X, Chen W. Borosilicate bioactive glass synergizing low-dose antibiotic loaded implants to combat bacteria through ATP disruption and oxidative stress to sequentially achieve osseointegration. Bioact Mater. 2024 Oct 18;44:184-204. 

doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.10.009. 

PMID: 39502840; 

PMCID: PMC11535878.