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色譜峰問題

色譜峰的問題，如色譜峰分離度差、色譜峰過寬、色譜峰分叉、色譜峰拖尾或前沿以及鬼峰等，通常是由色譜柱及其與流動相和樣品/稀釋劑的相互作用引起的。

色譜圖中無峰：原因有很多，包括進樣器沒有進樣、泵沒有提供相應的流量、漏液嚴重、檢測器死機、數(shù)據(jù)系統(tǒng)接線錯誤、流動相不正確、色譜柱保留性或吸附性特別差或樣品不正確。診斷此類問題的最佳程序是回到參考測試條件（通俗來說，就是之前好的且穩(wěn)定的儀器條件）。如果可以成功復制參考條件，從而推斷出系統(tǒng)運行正常，那么就可以針對具體的應用條件（色譜柱、流動相、樣品等）進行故障診斷。

色譜峰過寬或分裂：異常寬的峰和分裂峰是色譜柱性能下降的表現(xiàn)，其原因是樣品污染、部分入口篩板堵塞或色譜柱的柱效嚴重下降（圖 1 和 2）。

圖 1.可能由色譜柱空洞引起的色譜峰分裂示例。

圖 2. 因暴露于高 pH 值流動相而導致：性能良好的 C18 硅膠色譜柱和性能不佳的 C18 硅膠色譜柱的色譜圖對比。

可通過反向沖洗色譜柱、在色譜柱入口處重新填充填料或更換色譜柱（現(xiàn)在更常見的方法是更換色譜柱）來解決這些問題。請注意，早期洗脫峰的色譜峰比預期的要寬，這通常是由于高效液相色譜系統(tǒng)的柱外譜帶展寬造成的（圖 3）。對于小內徑的超高效液相色譜柱而言，這些柱外展寬效應尤其有害。

圖 3.  儀器譜帶展寬的影響示例，表明早期洗脫峰受到的影響更大。

若樣品溶液的溶劑強度大于流動相強度也會導致峰形異常（圖 4）。如果可能，用于溶解樣品的稀釋劑的強度應與流動相 A (MPA) 或梯度分析中的初始流動相相同或更弱。如果必須使用強度較高的溶劑作為最終樣品稀釋劑，則應保持較小的進樣體積（例如 HPLC 中 <2 ~ 5 μl），以防止早期洗脫峰的峰寬變寬或峰分裂。當樣品的 pH 值與流動相的 pH 值完全不同時，也會導致峰分裂。

圖 4. 用弱于和強于流動相強度的不同稀釋劑注入同一樣品溶液時出現(xiàn)的色譜峰異常示例。

倒峰：色譜圖中的倒峰或凹陷常見于溶劑前沿附近。它們是由折射率變化或吸光度低于流動相的樣品溶劑引起的。在溶劑前沿之后開始積分，通常可以忽略這些基線擾動。如果所有峰都是倒峰的，則可能是檢測器導線連接的極性錯誤，除非使用間接紫外檢測技術。在使用 RI 檢測器時，倒峰更為常見。

鬼峰和額外峰：與空白梯度分析（僅注入樣品溶劑進行梯度分析）相關的鬼峰通常是由較弱的流動相 (MPA) 中的痕量污染物造成的。通過使用純化試劑和采取嚴格的流動相制備預防措施，可將這種情況降至最低。意外的額外色譜峰，特別是那些異常寬的色譜峰，通常是由等度分析過程中先前進樣的后期洗脫色譜峰造成的（圖 5）。其中一些峰可能非常寬，以至于經(jīng)常被誤認為是基線漂移。

圖 5. 上一次進樣中的高保留峰洗脫造成意外寬峰的示例。

數(shù)據(jù)性能問題

精度差和結果不準確等數(shù)據(jù)性能問題可能很難診斷。數(shù)據(jù)問題可能源于系統(tǒng)故障或與流動相、方法校準或樣品制備有關的問題。幾篇已發(fā)表的文章（見文末）介紹了保留時間和峰面積的系統(tǒng)精度差及其可能的原因和補救措施。色譜法準確度差的原因可能是色譜峰共洗脫（色譜峰純度）、樣品穩(wěn)定性、樣品制備/回收問題、基質干擾、設備校準或積分問題（圖 6）。

圖 6.各種色譜峰積分問題示例

一個很好的指導原則是，打印報告時一定要顯示色譜峰基線，以檢查峰面積積分是否正確。出現(xiàn)數(shù)據(jù)問題時，通常需要經(jīng)驗豐富的從業(yè)人員提供正確的診斷和補救方法。如后期案例所示，應通過消除每個潛在原因來進一步調查這些問題。