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色譜中的選擇性（分離度）是指：一種方法將兩種分析物相互分離的能力。它的定義為：保留較強(qiáng)色譜峰的保留系數(shù)與保留較弱色譜峰的保留系數(shù)比值。通過改變流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的百分比、溶劑類型、柱和pH值，可以改變選擇性。這些變化對(duì)分離能力的影響順序如下：%B≈tG≈°C<溶劑類型≈柱類型<<pH。

為了在實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)這些變化是否能分離兩個(gè)共洗脫峰，建議做出以下改變：

改變 ±10%B（即有機(jī)相）；

用少 5~10% 的乙腈代替甲醇，或用 25~30% 的乙腈代替 35% 的甲醇；

尋找不同選擇性的色譜柱；

將 pH 值改變 4~5 個(gè)單位。

流動(dòng)相類型

對(duì)于溶劑（流動(dòng)相）而言，決定選擇性的因素主要是：溶劑的酸堿性和偶極特性。為了顯示每種溶劑的這些性質(zhì)，我們可以使用溶劑選擇性三角形來直觀顯示。在這樣的三角形中，頂點(diǎn)是三種具有 100% 堿性、 100% 酸性和 100% 偶極性的溶劑。如果存在這樣的溶劑，我們就可以根據(jù)這些溶劑的不同混合比例來定制我們需要的任何性質(zhì)。

然而，這種溶劑并不存在。由于最接近理想特性的溶劑不能混溶（如羧酸、胺和具有偶極特性的氯化溶劑），我們使用和嘗試混合的三種溶劑是醇（甲醇）、腈（乙腈）和醚（四氫呋喃）。溶劑選擇性三角形有助于做出明智的溶劑選擇和解決難以分離的峰。

圖 1. 溶劑選擇性三角形

流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度

與改變流動(dòng)相類型相比，改變流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度是一種更容易改變色譜峰保留的方法。通常這種方法足以分離色譜峰。不過，與改變流動(dòng)相類型相比，改變流動(dòng)相強(qiáng)度對(duì)選擇性的影響較小。因此，當(dāng)改變流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度后仍無法分離色譜峰時(shí)，建議改變流動(dòng)相類型。保留因子的變化與 %B 的函數(shù)關(guān)系如下式所示：

其中，kw 是純水中的保留因子。

只需兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)即可建立這種線性關(guān)系。斜率取決于分子量。因此，隨著兩個(gè)分析物之間分子量差異的減小，兩個(gè)分析物之間的分離度不會(huì)隨著 %B (φ) 的變化而發(fā)生顯著變化。

在進(jìn)行等度分離時(shí)，建議先使用高比例的有機(jī)相，然后以 10%B 的比例遞減。利用三倍原則（即 B 相變化10%，保留時(shí)間大約變化三倍）檢查相鄰色譜峰之間分離度，有助于預(yù)測(cè)最佳條件。需要注意的是，由于分析物的 S 值不同，φ 變化時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)峰交叉。

色譜柱類型

改變色譜柱化學(xué)成分是改變選擇性的有力工具。選擇性的差異可能來自硅膠載體材料、鍵合相的化學(xué)成分，或兩者兼而有之。在相同類型的硅膠上試用同一制造商生產(chǎn)的不同鍵合相的色譜柱時(shí)，選擇性的差異取決于鍵合相化學(xué)性質(zhì)的不同，因?yàn)楣枘z顆粒的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是相同的。

如果選擇性差異較大，則應(yīng)通過更換制造商和鍵合相來有針對(duì)性地改變硅膠載體類型和鍵合相。比較數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.hplccolumns.org/ database/index.php 和 http://apps.usp.org/app/USPNF/ columnsDB.html）中提供的色譜柱屬性，是選擇相似或不同選擇性色譜柱的更系統(tǒng)方法。這些數(shù)據(jù)庫(kù)包含近 700 種固定相，并提供了一種根據(jù) Fs 因子（即選擇性差異因子）比較固定相選擇性的方法。

表 2. 根據(jù)公式(2) 從疏水性差異評(píng)估模型計(jì)算出的FS因子

兩個(gè)色譜柱的 Fs 因子根據(jù)公式(2)計(jì)算。公式中的常數(shù)是根據(jù) "平均 "組成的 67 種成分樣品確定的權(quán)重系數(shù)。這些常數(shù)描述了平均樣品中每個(gè)色譜柱參數(shù)的相對(duì)重要性。隨著 FS 因子值的增加，兩個(gè)色譜柱之間的選擇性差異也會(huì)增加。表 2 列出了四個(gè)色譜柱的 FS 系數(shù)計(jì)算示例。FS 值為 3 或更小的色譜柱被認(rèn)為是等效色譜柱，匹配度極高。隨著 FS 值的增加，兩個(gè)色譜柱的選擇性差異也隨之增大，直到 FS 值達(dá)到 50 時(shí)，兩個(gè)色譜柱被認(rèn)為是正交的。

圖2中的雷達(dá)圖是一種用于理解五維空間中色譜柱比較的可視化工具，它展示了色譜柱選擇性差異的基礎(chǔ)。

圖2 基于疏水差異評(píng)估模型參數(shù)，四根色譜柱選擇性比較雷達(dá)圖。雷達(dá)圖的中心點(diǎn)表示：數(shù)據(jù)庫(kù)中觀察到的某參數(shù)的最小值，而頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)該參數(shù)的最高可能值。

例如，Acquity BEH Shield RP18 和 XBridge BEH C18 的 FS 值表明這兩種色譜柱具有不同的選擇性，但沒有進(jìn)一步詳細(xì)說明哪些參數(shù)不同。不過，雷達(dá)圖顯示，選擇性的差異主要是由于氫鍵堿性參數(shù)不同造成的。

與上述比較相反，XBridge BEH C18 和 Kinetex Biphenyl 之間選擇性的差異是由不止一個(gè)色譜柱參數(shù)的差異造成的。當(dāng)分析人員了解相鄰分析物的物理化學(xué)特性時(shí)，這種圖譜有助于選擇合適的色譜柱（例如，如果相鄰色譜峰中有一個(gè)分析物具有氫鍵給體點(diǎn)，則應(yīng)選擇氫鍵受體（B）能力強(qiáng)的色譜柱，如 Zorbax Bonus RP。

其中，H 指色譜柱的疏水性，S* 指空間位阻，A 指氫鍵酸性，B 指氫鍵堿性，C 指陽(yáng)離子交換活性。下標(biāo) 1 和 2 指比較的兩個(gè)色譜柱。

壓力

以不同流速（即相同流速×時(shí)間）運(yùn)行等效梯度時(shí)，可觀察到壓力對(duì)選擇性的影響。在這種等效梯度下，色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的變化表明壓力的變化導(dǎo)致了選擇性的變化。

壓力對(duì)選擇性影響的解釋并不直截了當(dāng)，因?yàn)榱魉俚脑黾影殡S著摩擦熱的增加。因此，溫度對(duì)選擇性也有影響。在反相色譜中，所有分子的保留率都會(huì)隨著壓力的增加而增加，極性分子和離子化分子受到的影響更大。

壓力對(duì)選擇性的影響隨著鍵合相鏈長(zhǎng)度的增加而增大。流動(dòng)相的水/有機(jī)物比率會(huì)影響壓力-選擇性效應(yīng)的大小。觀察結(jié)果與壓力改變時(shí)溶質(zhì)分子體積的變化一致。需要注意的是，改變壓力來調(diào)整選擇性并不實(shí)際，也不像改變色譜柱類型、溶劑強(qiáng)度或溶劑類型那樣簡(jiǎn)單。

溫度

溫度是改變選擇性的有效方法，尤其是對(duì)于離子型化合物。溫度的變化會(huì)導(dǎo)致 pH 值的變化，從而改變電離程度。因此，改變溫度與改變 pH 值具有相同的效果。對(duì)色譜柱溫度進(jìn)行微調(diào)（1~2°C）可用于調(diào)整緩沖液制備過程中的微小誤差。溫度的變化可能會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間、選擇性或峰形的變化?？赡軙?huì)出現(xiàn)綜合效應(yīng)。溫度升高，運(yùn)行時(shí)間縮短，峰形變窄。