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1. 背景介紹

 

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的核心分子，其功能由其三維結(jié)構(gòu)決定。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可分為四個(gè)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸序列）、二級(jí)結(jié)構(gòu)（α螺旋、β折疊等局部構(gòu)象）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（單個(gè)多肽鏈的全局折疊）和四級(jí)結(jié)構(gòu)（多亞基的組裝）。

 

例如，酶的催化活性依賴于活性中心的精確三維排布，膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能與其跨膜結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化密切相關(guān)。

 

（圖片來(lái)源：https://www.rcsb.org/#Category-analyze）

 

研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不僅能揭示其作用機(jī)制，還為藥物設(shè)計(jì)、疾病治療和合成生物學(xué)提供基礎(chǔ)。然而，蛋白質(zhì)的尺寸通常在納米級(jí)別，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀測(cè)，因此需要借助高分辨率技術(shù)解析其原子級(jí)結(jié)構(gòu)。

 

X射線晶體學(xué)（XRD）和冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）是當(dāng)前兩種最主流的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)。

 

2. 方法學(xué)比較

 

● X射線晶體學(xué)（XRD）

X射線晶體學(xué)的發(fā)展始于20世紀(jì)初，英國(guó)物理學(xué)家William Henry Bragg與其子William Lawrence Bragg開(kāi)創(chuàng)了X射線晶體學(xué)領(lǐng)域。他們提出的布拉格定律揭示了X射線與晶體原子排列的定量關(guān)系，為物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析奠定了數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。

 

這項(xiàng)技術(shù)的影響之深遠(yuǎn)，正如奧地利化學(xué)家馬克斯·佩魯茨所言：“27項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)不可或缺的配方”——截至20世紀(jì)末，X射線晶體學(xué)直接推動(dòng)了27項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)的誕生。1953年，英國(guó)科學(xué)家羅莎琳德·富蘭克林（Rosalind Franklin）利用X射線晶體學(xué)拍攝了DNA的B型衍射圖（“照片51號(hào)”）。

 

圖中的“X”形衍射斑直接提示了螺旋結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性——每圈10個(gè)堿基對(duì)，螺距34 Å。盡管富蘭克林因早逝未能獲得諾貝爾獎(jiǎng)，但她的這份圖像幫助詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克創(chuàng)建了DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，成為了生物學(xué)發(fā)展的一座里程碑。

 

（“照片51號(hào)”；圖片來(lái)源：https://assassinscreed.fandom.com/zh/wiki）

 

1958年，科學(xué)家在首個(gè)成像蛋白質(zhì)—肌紅蛋白內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不規(guī)則的褶皺，首次利用X射線晶體學(xué)解析了其結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著X射線晶體學(xué)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析領(lǐng)域的重大突破。

 

該技術(shù)的核心原理是利用X射線與蛋白質(zhì)晶體中原子的相互作用：當(dāng)X射線穿過(guò)高度有序的晶體時(shí)，晶格中的原子會(huì)使X射線發(fā)生衍射，形成特定的衍射圖案。

 

通過(guò)分析這些衍射點(diǎn)的位置和強(qiáng)度，結(jié)合數(shù)學(xué)方法（如傅里葉變換），可計(jì)算出蛋白質(zhì)的三維電子密度圖，進(jìn)而構(gòu)建原子模型。

 

（圖片來(lái)源：https://images.app.goo.gl/yfVo1LwXBFu5Dsxq5）

 

然而，該技術(shù)面臨兩大挑戰(zhàn)：蛋白質(zhì)結(jié)晶和相位問(wèn)題。許多蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白或柔性蛋白）難以形成高質(zhì)量晶體。例如，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）因跨膜區(qū)的不穩(wěn)定性，直到2004年通過(guò)引入抗體片段穩(wěn)定構(gòu)象才被成功解析。

 

相位問(wèn)題則源于X射線衍射僅能記錄振幅信息而丟失相位（波的相對(duì)位置），需借助分子置換法或引入重金屬原子（如硒代甲硫氨酸）來(lái)間接解決。

 

技術(shù)的進(jìn)步顯著提升了X射線晶體學(xué)的應(yīng)用范圍。同步輻射光源提供了高強(qiáng)度X射線，使數(shù)據(jù)采集速度更快、分辨率更高。X射線自由電子激光（XFEL）甚至能捕捉飛秒級(jí)動(dòng)態(tài)過(guò)程，例如光系統(tǒng)II分解水分子時(shí)的瞬時(shí)中間態(tài)。

 

● 冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）

冷凍電子顯微鏡的突破性進(jìn)展始于2010年代，被稱為“分辨率革命”。與X射線晶體學(xué)不同，Cryo-EM無(wú)需結(jié)晶，可直接分析溶液中的蛋白質(zhì)樣品。

 

其關(guān)鍵步驟包括：將蛋白質(zhì)樣品快速浸入-196℃的液乙烷中，使其在毫秒內(nèi)凍結(jié)成無(wú)定形的玻璃態(tài)冰，避免冰晶形成（冰晶會(huì)擠壓樣品導(dǎo)致結(jié)構(gòu)畸變）。玻璃態(tài)冰中的水分子呈無(wú)序狀態(tài)，包裹生物分子并維持其天然構(gòu)象。

 

隨后用高能電子束穿透樣品并記錄散射電子的信號(hào)。通過(guò)采集數(shù)萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)張二維投影圖像，利用計(jì)算機(jī)算法（如單顆粒分析）對(duì)隨機(jī)取向的顆粒進(jìn)行三維重構(gòu)。

 

（圖片來(lái)源：NobelPrize.org）

 

Cryo-EM技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)在于解析柔性或超大復(fù)合體的能力。例如，核糖體和病毒衣殼（如乙肝病毒）的精細(xì)結(jié)構(gòu)均通過(guò)Cryo-EM得以揭示。

 

此外，該技術(shù)能捕捉同一蛋白的多種構(gòu)象狀態(tài)。在新冠病毒研究中，Cryo-EM解析了刺突蛋白的“開(kāi)放”（結(jié)合宿主受體ACE2）和“閉合”（免疫逃逸）構(gòu)象，為疫苗設(shè)計(jì)提供了關(guān)鍵依據(jù)。

 

Cryo-EM技術(shù)瓶頸的突破主要依賴于硬件和算法的革新。直接電子探測(cè)器（DED）顯著提升了圖像信噪比，而深度學(xué)習(xí)算法（如cryoSPARC）實(shí)現(xiàn)了高效的數(shù)據(jù)處理和分類。

 

目前，Cryo-EM的最佳分辨率已接近2 Å，與X射線晶體學(xué)相當(dāng)，但對(duì)樣品的純度、濃度和均一性仍有較高要求。

 

3. 小結(jié)

 

X射線晶體學(xué)和冷凍電子顯微鏡是研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)的兩大支柱，兩種技術(shù)并非相互替代，而是形成互補(bǔ)。

 

X射線晶體學(xué)在原子級(jí)分辨率上具有優(yōu)勢(shì)，以原子精度揭示靜態(tài)細(xì)節(jié)，尤其適合小分子量、剛性且可結(jié)晶的蛋白質(zhì)。而Cryo-EM更擅長(zhǎng)處理超大復(fù)合體（如核孔復(fù)合物）或動(dòng)態(tài)過(guò)程（如分子伴侶輔助的蛋白質(zhì)折疊），以動(dòng)態(tài)視角捕捉構(gòu)象變化。

 

二者共同推動(dòng)了蛋白質(zhì)功能機(jī)制的解析。隨著技術(shù)進(jìn)步，XRD和Cryo-EM技術(shù)正與其他方法深度融合，人工智能（如AlphaFold）的介入進(jìn)一步加速了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的迭代。

這些發(fā)展將推動(dòng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)從單一分子解析邁向復(fù)雜系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)研究，最終實(shí)現(xiàn)“從原子到細(xì)胞”的全尺度生命理解。

 

4. 參考文獻(xiàn)

 

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https://digitalpaper.stdaily.com/http_www.kjrb.com/kjrb/images/2014-03/30/02/DefPub2014033002.pdf

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