中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

《中華人民共和國藥典》（2020 年版）（簡稱“《中國藥典》”）收載了9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則。同年，《美國藥典》（47 版）（簡稱“《美國藥典》”）也收載了1085 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則。表明細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在世界范圍內(nèi)經(jīng)過多年發(fā)展，為了應(yīng)對新的情況，均需要進(jìn)行新的官方解讀和指導(dǎo)。中、美兩國藥典中的內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則具有多項(xiàng)不同，本文參考《美國藥典》1085 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則和《中國藥典》9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則，對中美內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理、質(zhì)量管理的異同，指導(dǎo)原則中易誤讀的要點(diǎn)解讀等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行概括，為內(nèi)毒素檢測從業(yè)者提供參考。

 

 

 

凝膠法（Gel-clot technique）SOP示例

1 適用范圍

依據(jù)USP <85>, Ph. Eur. 2.6.14, Ch.P<1143> 和JP XVII Chapter 4.01制定的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法。該方法可支持產(chǎn)品開發(fā)的各個(gè)階段。

2 樣品要求

每種樣品至少準(zhǔn)備 1 瓶。

1)常規(guī)批次放行檢測時(shí)，分別對每批起始、中間和末尾的 1 瓶樣品進(jìn)行單獨(dú)檢測。

2)穩(wěn)定性檢測時(shí)，每個(gè)穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)檢測 1 瓶樣品，不得混合多個(gè)樣品瓶。

3 安全注意事項(xiàng)

始終遵循安全的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范。若不熟悉特定化學(xué)品的安全預(yù)防措施，處理前需查閱相應(yīng)的安全數(shù)據(jù)表（SDS）。

4 儀器與設(shè)備

1)微孔板（96 孔）

2)去熱原或無熱原稀釋管

3)用于對玻璃器皿進(jìn)行去熱原處理的熱空氣烘箱或馬弗爐（250°C）

4)無熱原血清移液管

5)無熱原艾本德移液器及吸頭

6)渦旋混合器

7)石蠟?zāi)?/span>

8)校準(zhǔn)定時(shí)器

9)酶標(biāo)儀（Bio - Tek® 型號(hào) ELx - 808，BioTek 儀器公司生產(chǎn)）

10)內(nèi)毒素分析軟件，Endoscan V

5 溶劑 / 試劑 / 化學(xué)品

1)控制標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）

2)Endochrome - K 裂解物試劑（Charles River 公司生產(chǎn)）

3)LAL 試劑水（LRW）

6 溶液制備

注：EU（內(nèi)毒素單位）和 IU（國際單位）為等效單位。

6.1 LAL 試劑水（LRW）

使用經(jīng)認(rèn)證的 LRW 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，并制備陽性對照。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1)按照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的復(fù)溶和儲(chǔ)存說明進(jìn)行操作。CSE 的效價(jià)與其配套的裂解物相關(guān)。根據(jù)供應(yīng)商的分析證書，確認(rèn)特定 CSE - 裂解物組合的正確復(fù)溶體積。

2)查閱 CSE 產(chǎn)品說明書，獲取穩(wěn)定性信息和產(chǎn)品限制條件。

3)按廠家說明復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品，渦旋 5 分鐘。用無熱原水制備標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液，操作如下（每次稀釋前渦旋 1 分鐘，再進(jìn)行后續(xù)稀釋）：

復(fù)溶后的內(nèi)毒素 = 50 EU/mL

0.5 mL（50 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 5.0 EU/mL

0.5 mL（5 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.5 EU/mL

0.5 mL（0.5 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.05 EU/mL

0.5 mL（0.05 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.005 EU/mL

每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0 - 0.005 EU/mL）均需在兩個(gè)孔中進(jìn)行檢測。

B.樣品制備說明

1)用 1 mL LRW 復(fù)溶樣品（5 mg/mL）。

2)1:50 稀釋：取 0.1 mL 樣品加入去熱原容器，再加入 4.9 mL LRW，充分渦旋混勻。最終稀釋液在兩個(gè)孔中進(jìn)行檢測。將數(shù)據(jù)輸入Endoscan - V 軟件時(shí)，孔位布局讀數(shù)為0.1000，結(jié)果以 EU/mg 表示。

C.對照設(shè)置

1)陽性產(chǎn)品對照（PPC）：為每個(gè)樣品制備 PPC，直接在檢測板上向 100 µL 樣品中加入 10 µL 濃度為 5.0 EU/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品（由 CSE 制備），加入的內(nèi)毒素常稱為 “加標(biāo)”。檢測板上的名義濃度為 0.5 EU/mL。

2)陰性對照（NC）：使用 LRW 作為陰性對照（見下文 7 檢測步驟部分），陰性對照需在兩個(gè)孔中進(jìn)行檢測。

6.2（Endochrome K）裂解物試劑

小心取下小瓶瓶塞，向凍干的裂解物小瓶中加入 3.2 mL LRW。重新塞上瓶塞，輕輕顛倒混勻數(shù)次，請勿渦旋。若樣品數(shù)量足夠，需要使用多個(gè)小瓶時(shí)，將各小瓶內(nèi)容物混合。復(fù)溶后的裂解物可在 2 - 8°C 儲(chǔ)存，最長不超過 24 小時(shí)。

7 檢測步驟

1)根據(jù)需要準(zhǔn)備檢測儀器。對于酶標(biāo)儀，需輸入樣品描述信息、設(shè)置檢測參數(shù)，并開啟設(shè)定為 37 ± 1°C 的孵育器。

2)按照以下示例檢測板布局，將 100 µL 每種標(biāo)準(zhǔn)品分別加入兩個(gè)孔中（此為示例，也可使用其他布局）。

3)按照示例檢測板布局，將 100 µL 陰性對照分別加入兩個(gè)孔中。

4)按照示例檢測板布局，將 100 µL 每種樣品稀釋液分別加入兩個(gè)孔中。

5)制備陽性產(chǎn)品對照，按照示例檢測板布局（例如樣品 1 加標(biāo)孔），向兩個(gè)孔中分別加入10 µL 濃度為 5.0 EU/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，然后加入 100 µL 樣品稀釋液。對每個(gè)檢測樣品均制備陽性產(chǎn)品對照。

6)在樣品分析前，將檢測板在 37 ± 1°C 預(yù)孵育至少 10 分鐘。預(yù)孵育完成后再加入裂解物試劑。

7)在孵育期間準(zhǔn)備裂解物試劑。

8)向所有檢測孔中加入 100 µL 裂解物試劑。將檢測板放入設(shè)置好的酶標(biāo)儀中，用于動(dòng)態(tài)顯色法 LAL 檢測，開啟自動(dòng)混合功能（低強(qiáng)度，10 秒），孵育器溫度設(shè)定為 37 ± 1°C。確認(rèn)選擇多項(xiàng)式回歸分析。

注：設(shè)置檢測，使用三次多項(xiàng)式曲線評估數(shù)據(jù)，以獲得最佳數(shù)據(jù)擬合。

9)讀取檢測結(jié)果：

按照顯色檢測方法設(shè)定，測量吸光度，檢測時(shí)間為 1 小時(shí)，或直至最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到起始吸光度（OD）。由于檢測方法靈敏度較高，需確保檢測時(shí)間足夠長，以達(dá)到起始 OD 值。

 

示例檢測板布局：

8 系統(tǒng)要求

1)檢測中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r 值）絕對值必須大于或等于0.980。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率必須在 -0.12 至 -0.35 之間。

3)為確保檢測有效，陰性對照的平均反應(yīng)時(shí)間必須大于最低標(biāo)準(zhǔn)濃度的反應(yīng)時(shí)間，即陰性對照的內(nèi)毒素濃度低于最低標(biāo)準(zhǔn)濃度。

4)為確保樣品不會(huì)顯著干擾 LAL / 內(nèi)毒素反應(yīng)，陽性產(chǎn)品對照的測量內(nèi)毒素濃度必須在等效標(biāo)準(zhǔn)品名義濃度的 50% 至 200% 范圍內(nèi)。在確定陽性產(chǎn)品對照中加標(biāo)內(nèi)毒素是否回收之前，可能需要減去樣品中測量的內(nèi)毒素濃度，此計(jì)算由 Endoscan - V 軟件完成。

5)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品重復(fù)檢測的變異系數(shù)（% CV）必須≤10%。

若上述任何系統(tǒng)適用性或有效性標(biāo)準(zhǔn)未滿足，則該檢測可能被判定無效，需重復(fù)檢測。

9 限值

不得超過 1 EU/mg

10 報(bào)告

結(jié)果以 EU/mg 報(bào)告，精確到整數(shù)位。未檢測到內(nèi)毒素時(shí)，結(jié)果報(bào)告為 < 0.05 EU/mg。

注：EU 和 IU 為等效計(jì)量單位。

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1]裴宇盛,陳晨,蔡彤,趙小燕,高華.中、美藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則的比較和解讀[J/OL].中國藥物警戒:1-8[2022-11-03].DOI:10.19803/j.1672-8629.20211190.

 

[2] Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China Vol IV(中華人民共和國藥典,四部)[S]. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 19.

 

[3]The United States Pharmacopeial Convention. U.S.Pharmacopeia 43/ National Formulary 38[M]. Baltimore: United Book Press, 2020.