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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-19 20:40
摘 要： 建立氣相色譜測定瓊脂糖微球中司盤85含量的分析方法。通過油酸濃度的換算得到司盤85的含量，以油酸為外標，用氣相色譜法進行定量分析。采用DB-FFAP 色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm），載氣為氮氣，尾吹流量為30 mL/min，進樣口溫度為240 ℃，采用氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度為280 ℃，色譜柱流量3.0 mL/min，程序升溫。在該色譜條件下，各物質(zhì)能有效分離，質(zhì)量濃度在6～100 μg/mL 范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，方法檢出限為6.75 μg/mL，定量限為11.25 μg/mL。樣品回收率為96.62%～98.84%，測定結(jié)果的相對標準偏差小于0.9%（n=6）。該方法克服了待測制劑中其他組分干擾的問題，進一步提高了檢測靈敏度和專屬性。
關(guān)鍵詞： 氣相色譜法； 瓊脂糖微球； 司盤85； 油酸
司盤85又名三油酸山梨坦，是山梨坦與三分子油酸形成酯的混合物，系山梨醇脫水，在堿性催化下，與三分子油酸酯化而制得，或由山梨醇與三分子油酸在180～280 ℃下直接酯化制得，被廣泛用作乳化劑、潤滑劑、潤濕劑、分散劑、增稠劑等，常用于食品、藥品、化妝品等領域[1]。
筆者選擇司盤85作為乳化劑用于制備瓊脂糖微球，攪拌使司盤85與油相充分混合，在乳化過程中油相與水相均勻而穩(wěn)定地分散混合，從而獲得完整且表面形貌良好的球形[2?4]。制得的乳液經(jīng)無水乙醇和純化水洗滌即可得到不含有機溶劑的潔凈瓊脂糖微球[5]。潔凈的瓊脂糖微球不僅可以作為介質(zhì)，用于不同物質(zhì)的分離和分析[6?7]，還可以作為載體，應用于醫(yī)藥領域[8]。依據(jù)目前中國藥典和新藥審批規(guī)定，需對藥物合成中的殘留溶劑進行控制，否則產(chǎn)品中的殘留溶劑可能會對人體產(chǎn)生危害[9]。司盤85作為一種有機溶劑，其殘留量的檢測至關(guān)重要。
目前，司盤類試劑的檢測方法有滴定法、薄層色譜分析方法、高效液相色譜法和氣相色譜法。其中，薄層色譜分析方法與滴定法精確度差，適用于定性分析[10]；液相色譜法的靈敏度差，檢測過程中出現(xiàn)多個色譜峰，多個色譜峰之間的分離度較差[11]；氣相色譜法檢測司盤類試劑的處理過程復雜，耗時較長[12]，因此需要一種簡單快速檢測司盤類試劑的方法?！吨腥A人民共和國藥典》（2020年版）四部建議根據(jù)脂肪酸組成評估司盤85的含量，但該方法所用對照品較多且操作復雜。
依據(jù)油酸在脂肪酸中占比65%~88%，脂肪酸在司盤85中占比85.5%~90%，計算得到油酸在司盤85中占比為0.555~0.792。以油酸為外標，利用氣相色譜法檢測瓊脂糖微球中油酸濃度，再計算出微球中司盤85含量，該方法不僅簡便、快速，克服了待測制劑中其他組分干擾的問題，進一步提高了檢測靈敏度和專屬性。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
精密電子天平：PX224ZH/E型，感量為0.1 mg，奧豪斯儀器（常州）有限公司。
氣相色譜儀：島津-GC2014C型，配有氫火焰離子化（FID）檢測器，日本島津有限公司。
數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-1型，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司。
油酸：質(zhì)量分數(shù)不低于98%，江西佰草源生物科技有限公司。
甲醇：色譜純，質(zhì)量分數(shù)不低于99.9%，國藥集團化學試劑有限公司。
三氟化硼甲醇溶液：10%，上海麥克林生化科技有限公司。
氫氧化鉀、正己烷、氯化鈉：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
高純氮氣：質(zhì)量分數(shù)為99.999%。
瓊脂糖微球樣品：批號分別為20240108、20240319、20240408，自制。
1.2 儀器工作條件
色譜柱：DB-FFAP，硝基對苯二甲酸改性的聚乙二醇強極性色譜柱[30 m×0.32 mm，0.5 μm，安捷倫科技（中國）有限公司]；檢測器溫度：280 ℃；載氣：高純氮氣，流量為30 mL/min；進樣口溫度：240 ℃；進樣方式：分流進樣，分流比為38∶1；柱升溫程序：初始溫度為 150 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持10 min；平衡時間：3.0 min；進樣量：1 μL。
1.3 溶液的制備
油酸標準溶液：稱量油酸標準品0.01 g于50 mL離心管中，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液4 mL，加入10%三氟化硼甲醇溶液7 mL，加正己烷5 mL，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，搖勻，靜置分層后分別取上層液，獲得標準溶液。
油酸系列標準工作溶液：分別移取油酸標準溶液30、40、50、100、200、500 μL于10 mL容量瓶中定容，混勻，用0.22 µm濾膜過濾，制備得油酸的質(zhì)量濃度分別為6、8、10、20、40、100 μg/mL的系列標準工作溶液。
瓊脂糖微球：稱取4.8 g瓊脂糖粉末于160 ml純化水中，121 ℃滅菌15 min，使瓊脂糖粉末充分溶解，作為水相備用。稱取20 g司盤85于300 g液體石蠟中，在60 ℃的水浴鍋中攪拌30 min，使司盤85與液體石蠟充分混合，作為油相備用。將油相倒入水相中，在60 ℃的水浴鍋中進行乳化均質(zhì)，均質(zhì)5 min后停止反應，攪拌槳攪拌30 min降溫至室溫。乳化結(jié)束后，將反應液倒入含有乙酸乙酯-乙醇（體積比為7∶3）的清洗液中進行攪拌清洗3次，離心后繼續(xù)用純化水清洗3次，篩網(wǎng)過濾得瓊脂糖微球[5]。相同方法制備3批瓊脂糖微球。
供試品（瓊脂糖微球）溶液：精確取瓊脂糖微球2.0 g，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液4 mL，在65 ℃水浴中回流10 min，放冷，加入10%三氟化硼甲醇溶液7 mL，在65 ℃水浴中加熱回流2 min，放冷，加正己烷5 mL，繼續(xù)回流1 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，搖勻，靜置分層取上層液，過濾，獲得供試品溶液。
1.4 實驗步驟
使用氣相色譜儀按照1.2儀器工作條件檢測油酸系列標準工作溶液，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，建立油酸的標準曲線；同法檢測樣品溶液，利用色譜峰面積外標法計算出樣品中油酸的質(zhì)量濃度，將所得油酸濃度帶入式（1）計算瓊脂糖微球樣品中司盤85含量：
(1)
式中：ρ——樣品中司盤85含量，μg/mL；
ρ0——樣品中油酸濃度，μg/mL；
w——司盤85中油酸質(zhì)量分數(shù)，0.555～0.792；
m——稱取的樣品質(zhì)量，g。
2. 結(jié)果與討論
2.1 脂肪酸衍生方法的選擇
大多數(shù)脂肪酸沸點較高，且在高溫條件下不穩(wěn)定、易裂解，分析過程中容易造成損失，因此需要對脂肪酸進行衍生化處理后才能定量分析[13]。目前常用的衍生化方法主要有酸催化法、堿催化法和重氮甲烷法[14]，而由于重氮甲烷法毒性較強，濃度較高時易發(fā)生爆炸，堿催化法易使脂肪酸失去活性，因此選擇酸催化法對脂肪酸進行衍生化處理。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部選擇三氟化硼甲醇溶液對脂肪酸進行甲酯化處理。
2.2 色譜條件的選擇
2.2.1 色譜柱的選擇
目前常用于脂肪酸甲酯化檢測的色譜柱為極性固定相色譜柱，比較了聚乙二醇（DB-FFAP）與(88%-氰丙基)芳基-聚硅氧烷（HP-88）對脂肪酸甲酯分離效果。通過試驗發(fā)現(xiàn)HP-88色譜柱檢測時間較長，而DB-FFAP色譜柱對油酸的分離效果較好且檢測時間較短，因此選擇DB-FFAP色譜柱進行試驗。
2.2.2 載氣流量的選擇
由速率理論可知，載氣流量快慢會影響樣品中組分分離效果以及峰型，如過高的載氣流量會使組分流失，影響測定的靈敏度，過低的載氣流量會造成峰拖尾現(xiàn)象[15]。一般載氣流量的選擇范圍為10～100 mL/min。根據(jù)多次試驗結(jié)果和實際色譜柱柱效表明，選擇30 mL/min的載氣流量為最適流量。
2.3 標準品處理方法調(diào)整
根據(jù)《中華人民共和國藥典》檢測三油酸山梨坦的方法，將油酸標準品進行冷凝回流和未回流處理。結(jié)果顯示，經(jīng)回流處理的油酸峰面積比未經(jīng)回流處理的峰面積低，說明冷凝回流會造成標準品的部分損失，故采用不回流的處理方式進行標準品的制備。
2.4 專屬性試驗
精密量取油酸標準溶液、樣品溶液、供試品溶液各1 mL，按照1.4實驗步驟進行檢測，各溶液的色譜圖見圖1。
1—供試品溶液；2—標準溶液；3—樣品溶液圖1 油酸標準溶液、供試品溶液和樣品溶液的色譜圖
Fig. 1 Chromatograms of oleic acid standard solution、test sample - standard solution and sample solution
由圖1可知，3種溶液的保留時間均在同一位置，在目標峰出現(xiàn)的位置確屬于待檢測的油酸峰，證明該方法的專屬性很高，檢測過程中不會出現(xiàn)雜峰的干擾。
2.5 線性關(guān)系、檢測限與定量限試驗
按照1.4方法檢測油酸系列標準工作溶液，并計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，油酸質(zhì)量濃度在 6～100 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性方程為y=93.973x-304.67，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 2。
以3倍信噪比對應的油酸質(zhì)量濃度確定檢測限為6.75 μg/mL，以10倍信噪比對應的油酸質(zhì)量濃度確定定量限為11.25 μg/mL。
2.6 精密度試驗
配制6份凝膠樣品溶液，按1.4實驗步驟進行檢測，考察微球樣品油酸含量和保留時間的相對標準偏差，試驗結(jié)果見表1。由表1可知，樣品中油酸含量測定結(jié)果的相對標準偏差為2.92%，保留時間的相對標準偏差為0.07%，表明該方法的重現(xiàn)性很好，具有很高的精密度，能夠滿足定量分析的要求。
表1 精密度試驗結(jié)果
Tab. 1 Precision test results
2.7 穩(wěn)定性試驗
取1份樣品溶液，分別在 0、2、4、6、12、24 h進樣測定，試驗結(jié)果見表2。
表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Tab. 2 Stability test results
由表2可知，油酸峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差為0.87%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.8 回收率試驗
稱取已知組分含量的透明質(zhì)酸凝膠樣品溶液，用標準加入法分別測定20、25、30 μg/mL 3個加標水平下油酸的回收率，每組樣品6份，試驗結(jié)果見表3。由表3可知，油酸平均回收率為96.62%～98.84%，表明該方法的準確度很高，滿足樣品的分析要求。
表3 回收率試驗結(jié)果
Tab. 3 Recovery rate test results
2.9 樣品測定
取適量樣品，按照1.3方法制備供試品溶液，在1.2儀器工作條件下測定，計算司盤85含量。結(jié)果批號為20240108、20240319、20240408的樣品中均未檢出司盤85試劑殘留。
3. 結(jié)語
通過優(yōu)化對油酸標準品的處理，利用氣相色譜儀對含有司盤85的待測樣品進行檢測。以油酸為標準品，正己烷為溶劑，通過油酸含量換算得到司盤85的含量。與《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部相比，該檢測方法簡化了制備步驟，檢測快速，線性良好，克服了待測制劑中其他組分干擾的問題，增強了專屬性，對司盤85含量檢測具有重要意義。
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來源：化學分析計量
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