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在液相色譜分析中，我們會遇到各種問題，需要分析人員有足夠的知識和能力來解決這些問題。本期筆者將翻譯一篇綜述，原文為：【Necessary Analytical Skills and Knowledge for Identifying, Understanding, and Performing HPLC Troubleshooting】（即識別、理解和執(zhí)行 HPLC 故障解決所需的分析技能和知識）。

流動相緩沖液

緩沖液的選擇和制備

流動相中緩沖液的作用是防止 pH 值發(fā)生變化。當(dāng)樣品或色譜柱中含有酸性或堿性成分時(shí)，就需要使用緩沖液。為精確控制 pH 值，緩沖液應(yīng)在其最大緩沖能力下使用，即在其 pKa 的 ±1 個(gè) pH 單位范圍內(nèi)使用。與緩沖液 pKa 相差 2 個(gè) pH 單位時(shí)，緩沖能力會下降 25 倍。制備緩沖液的常見方法包括：

使用緩沖液計(jì)算器程序，如 ([https://www.zirchrom.com/pass. asp])；

使用 Henderson-Hasselbalch 方程；該方程提供了酸（或堿，在水溶液中）的 pH 值與其 pKa（酸解離常數(shù)）之間的關(guān)系。當(dāng)已知酸（堿）及其共軛堿（酸）的濃度時(shí)，可借助該方程估算緩沖溶液的 pH 值。

通過滴定直到達(dá)到目標(biāo) pH 值。

磷酸鹽緩沖液易于制備、純度高、pH 值范圍合適、紫外吸收率低。但是，它們不是質(zhì)譜（MS）友好型緩沖液。磷酸鹽緩沖液適用于以下 pH 值范圍：2-3.1 和 6.2-8.2。乙酸鹽緩沖液因其揮發(fā)性而對質(zhì)譜儀友好，但應(yīng)注意防止選擇性蒸發(fā)。建議在高 pH 值條件下使用有機(jī)緩沖液，而不是磷酸鹽緩沖液，以盡量減少硅膠的溶解?？墒褂玫母?pH 值緩沖液有三(羥甲基)氨基甲烷、吡咯烷、三甲胺和甘氨酸等，如果可能，建議在 A 相（水相）和 B 相（有機(jī)相）中使用相同濃度的緩沖液 。

水有機(jī)混合物中的緩沖液

部分水溶液的 pH 值難以解釋，而且與水溶液不同。

與有機(jī)溶劑存在相關(guān)的 pH 值變化有四個(gè)原因：

由于有機(jī)溶劑的存在，pH 傳感電極和參比電極之間的金屬塊上產(chǎn)生了小電流，導(dǎo)致交界電位發(fā)生變化。這種變化導(dǎo)致校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的結(jié)點(diǎn)電位不同。

解離常數(shù)的變化（KW = 10-14）。在水溶液中，[H]+=[OH]- 時(shí)為中性，而在甲醇中，[H]+=[CH3O]- 時(shí)為中性。因此，pH=7 不再是甲醇的中性狀態(tài)，而是 8.3。

溶液性質(zhì)（如溶劑成分或溫度）的變化導(dǎo)致 pH 值的變化。

緩沖 pKa 的變化。與水相比，有機(jī)溶劑的介電常數(shù)較低，因此離子的解離方式不同。如果有機(jī)成分在溶劑中的比例低于 50%，則水性溶劑和水性有機(jī)溶劑的 pH 值差異最小。不過，如果將有機(jī)溶劑中的 pH 值與水溶劑中的 pH 值進(jìn)行比較，兩者之間的差異可能高達(dá)兩個(gè) pH 單位或更多。

離子對試劑的優(yōu)勢和劣勢

分析人員的主要選擇是在低 pH 值（2~3）條件下操作，在這種條件下有多種色譜柱可供選擇。在低 pH 值條件下，酸性和中性樣品不會被電離，可以很好地保留下來。另一方面，堿性樣品會被質(zhì)子化并保留下來（如果它們有一個(gè)主要的非極性鏈），如果分子是極性的，則不會被保留下來。

離子對試劑具有離子末端和非極性尾部，將其加入流動相中可提高極性分子的保留率。保留增強(qiáng)的機(jī)理如下。首先，離子對試劑的非極性尾部被固定相中的非極性鏈緊緊抓住，而離子部分則被導(dǎo)向流動相。

然后，離子對試劑的離子部分將保留電荷相反的離子化合物。對于帶正電荷的離子堿，可使用帶負(fù)電荷的離子對試劑，如烷基磺酸。帶負(fù)電荷的離子酸可使用帶正電荷的離子對試劑，如四丁基氯化銨。

圖 1. 十二烷基磺酸鈉（上圖）和四丁基氯化銨（下圖）。

添加離子對試劑會降低方法的穩(wěn)健性。但有時(shí)，當(dāng)一些離子化峰在死體積中洗脫時(shí)，添加離子對試劑就能解決分離問題。需要注意的是，添加離子對試劑后，中性化合物的保留時(shí)間會縮短，因?yàn)殡x子對試劑會占據(jù)部分固定相。在為等度方法選擇離子對試劑的最佳濃度時(shí)，建議使用兩種流動相，一種含離子對試劑，另一種不含。通過混合兩種流動相，逐步提高離子對試劑的濃度，直到第一個(gè)峰的保留因子大于 1，即可找到離子對試劑的最佳濃度?？赏ㄟ^改變溫度、pH 值或甲醇的百分比來微調(diào)保留因子。

圖 2. 離子對試劑示意圖

在使用離子對試劑時(shí)需要注意一些事項(xiàng)：

固定相中離子對試劑的濃度取決于有機(jī)相比例和溫度；

固定相中離子對試劑的濃度平衡較慢，即需要 20-50 個(gè)柱體積才能平衡；

某些離子對試劑具有很強(qiáng)的紫外吸光度；

離子對試劑不易從柱上洗掉；

使用微量離子對試劑會改變選擇性。由于溫度變化、pH 值變化、流動相和樣品溶劑之間的 pH 值不匹配、離子對濃度不足以及使用 pH 值調(diào)整過的流動相而非真正的緩沖液，使用離子對的方法的保留時(shí)間可能會發(fā)生變化。

離子對試劑的替代品包括：

三氟乙酸，因?yàn)樗勺鳛榇笊锓肿拥碾x子對試劑，且平衡速度快；

極性嵌入相柱或適用于 100% 水的柱子；

如果所有樣品都離子化，則使用離子交換代替離子對試劑；

混合模式固定相，其電荷靠近烷基固定相鏈的基部。