中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

1. 實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)染色是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其原理基于考馬斯亮藍(lán)（如R-250和G-250）與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合。

當(dāng)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其分子構(gòu)象發(fā)生改變，形成藍(lán)色復(fù)合物并富集于蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域，凝膠中原本透明的蛋白質(zhì)條帶因染料聚集而顯現(xiàn)藍(lán)色。

這一顯色機(jī)制主要由染料磺酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)堿性氨基酸殘基（如精氨酸、賴(lài)氨酸）之間的靜電引力驅(qū)動(dòng)，同時(shí)伴隨范德華力和疏水相互作用的協(xié)同效應(yīng)。

顯色強(qiáng)度與靶蛋白中堿性氨基酸的豐度及染料結(jié)合效率密切相關(guān)。

圖片來(lái)源：https://images.app.goo.gl/iswfooKkfNQNZrK78

考馬斯亮藍(lán)分為G-250和R-250兩類(lèi)。

G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸收波長(zhǎng)為465 nm；與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，復(fù)合物的最大吸收峰移至595 nm，且吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。由于結(jié)合迅速，G-250常用于溶液中的蛋白質(zhì)定量（如Bradford法）。

R-250與蛋白質(zhì)結(jié)合速度較慢，但可通過(guò)甲醇-乙酸溶液去除未結(jié)合的染料（脫色步驟），因此更適用于電泳凝膠中蛋白質(zhì)條帶的染色。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

耗材：SDS-PAGE凝膠、染色槽

試劑：

考馬斯亮藍(lán)R250染色液：稱(chēng)取0.25 g考馬斯亮藍(lán)R250，加入45 mL甲醇和10 mL冰醋酸，用超純水補(bǔ)足至100 mL，充分混勻。

脫色液：取250 mL甲醇與80 mL冰醋酸混合，再用超純水定容至1000 mL，混合均勻后備用。

ddH2O

設(shè)備：搖床、電泳儀

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 電泳

通過(guò)SDS-PAGE電泳來(lái)分離蛋白質(zhì)，在這個(gè)過(guò)程中，要按照蛋白質(zhì)的大小和其所帶電荷的狀況，選擇濃度適宜的凝膠（小分子用濃度大的，大分子用濃度小的）。

3.2 染色

電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用水沖洗干凈。隨后加入考馬斯亮藍(lán)染色液完全浸沒(méi)，并在室溫下?lián)u床染色約30 min或更長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速為50-150r/min，具體時(shí)間可依據(jù)凝膠厚度和實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整，直至顏色接近染液。

3.3 去染

染色結(jié)束后，棄去或回收染色液（一般可重復(fù)使用2-3次）。隨后進(jìn)行脫色處理，一般脫色時(shí)間為2-3 h，期間需更換脫色液，直至藍(lán)色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶清晰可見(jiàn)。如需背景更低的凝膠，則需用純水浸泡過(guò)夜。

3.4 拍照和分析結(jié)果

脫色完畢后應(yīng)盡快拍照，防止凝膠上蛋白和染料的流失。

如圖所示為考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果圖：按照從左到右的順序，在電泳實(shí)驗(yàn)中依次加入上樣量為20 μg和10 μg的Hela細(xì)胞裂解液，以及上樣量為500 ng、100 ng、50 ng、10 ng的BSA純化蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色后的膠圖。

BSA純化蛋白組為陽(yáng)性對(duì)照，可進(jìn)一步評(píng)估蛋白分離效果，因?yàn)锽SA純化蛋白的分子量相對(duì)明確且單一，在電泳過(guò)程中會(huì)根據(jù)其分子量大小在凝膠中遷移到特定位置。

圖片來(lái)源于：https://bio.vazyme.com/products_7/28.html

4. 注意事項(xiàng)

染色時(shí)間取決于凝膠厚度和溫度。較厚的凝膠或較低溫度需延長(zhǎng)時(shí)間，較薄的凝膠或較高溫度則可縮短。一般當(dāng)凝膠顏色接近染液且難以分辨時(shí)，說(shuō)明染色已完成。適當(dāng)延長(zhǎng)至2～4 h或更久，不會(huì)影響最終效果。

脫色完成后，可將凝膠浸泡在水中以備拍照或其他后續(xù)操作。但長(zhǎng)期浸泡可能導(dǎo)致凝膠溶漲，若需避免，可存放于20%甘油溶液中。此外，凝膠也可制備成干膠以便長(zhǎng)期保存。

在蛋白免疫印跡技術(shù)體系中，考馬斯亮藍(lán)與麗春紅作為互補(bǔ)性染色劑被廣泛應(yīng)用于不同檢測(cè)階段，考馬斯亮藍(lán)G-250染色液可達(dá)成以下三個(gè)目的：

驗(yàn)證電泳參數(shù)有效性（如電流設(shè)置、膠體濃度匹配度）；

評(píng)估轉(zhuǎn)膜完整性（未轉(zhuǎn)出蛋白在凝膠對(duì)應(yīng)分子量位置仍殘留可見(jiàn)條帶）；

純化蛋白實(shí)驗(yàn)時(shí)檢測(cè)目的蛋白是否被純化出來(lái)。

與之形成對(duì)比的是，麗春紅憑借其可逆結(jié)合特性，常被用于短暫染色PVDF/NC膜，通過(guò)肉眼觀察紅色條帶分布既可快速判斷轉(zhuǎn)膜均勻性，又能在BSA封閉液處理前通過(guò)脫色緩沖液（TBS-T）完全去除染料，避免干擾后續(xù)抗體結(jié)合。