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本研究旨在建立乳酸環(huán)丙沙星的微生物限度檢查方法以及乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的無(wú)菌檢查方法。試驗(yàn)方法嚴(yán)格遵循《中國(guó)藥典》2020 年版四部的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸環(huán)丙沙星原料藥采用微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，各菌回收比值均在 0.5 ～ 2.0 之間；控制菌大腸埃希菌可檢出陽(yáng)性試驗(yàn)菌。乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無(wú)菌檢查方法采用薄膜過(guò)濾法，6 種試驗(yàn)菌均能檢出?；谝陨辖Y(jié)果，本研究得出結(jié)論：乳酸環(huán)丙沙星的微生物限度檢查方法以及乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的無(wú)菌檢查方法，均適宜采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行。

 

環(huán)丙沙星展現(xiàn)出了顯著的抑菌效果，目前在臨床上主要用于治療由敏感菌引起的泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)感染等疾病，屬于第三代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物 [1]。乳酸環(huán)丙沙星是環(huán)丙沙星與乳酸形成的鹽類(lèi)，與環(huán)丙沙星相比，乳酸環(huán)丙沙星具有更高的藥物吸收率，以及抗菌譜廣、穿透力強(qiáng)、組織濃度高的特性 [2-4]。目前，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)目中的微生物學(xué)檢查是確保用藥安全的關(guān)鍵指標(biāo)之一 [5]。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則，對(duì)于需要控制藥品質(zhì)量的微生物檢驗(yàn)方法有明確的規(guī)定：必須對(duì)其相關(guān)檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證 [6]，以避免因方法不當(dāng)導(dǎo)致的漏檢和誤判。本研究根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則中無(wú)菌檢查以及微生物限度檢查的要求 [7]，以乳酸環(huán)丙沙星原料及其制劑為研究對(duì)象，對(duì)微生物限度和無(wú)菌檢查的方法適應(yīng)性試驗(yàn)進(jìn)行了全面的研究，旨在為藥品的生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗(yàn)提供可行、有效、安全、可控的依據(jù)。

 

1.材料與儀器

1.1 儀器

本研究使用了 HTY-302G 微生物限度檢測(cè)儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）、BHC-1300 IIB2 生物安全柜（廣州蘇信環(huán)?？萍加邢薰荆RH-800生化培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、YT-601 集菌儀（杭州盈天科學(xué)儀器有限公司）以及層流凈化工作臺(tái)（廣州蘇信環(huán)?？萍加邢薰荆?/span>

1.2 樣品與試劑

試驗(yàn)中使用了乳酸環(huán)丙沙星原料藥，批號(hào)分別為 210810，210709，220109，由浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司提供；以及乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液，批號(hào)分別為 221202101，221203101，221203102，由廣東大翔制藥有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)用菌種

試驗(yàn)所用菌種包括金黃色葡萄球菌 CMCC(B)220422、黑曲霉 CMCC(B)220805、白色念珠菌 CMCC(B)220816、銅綠假單胞菌 CMCC(B)220806、大腸埃希菌 CMCC(B)220915、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)220402、生孢梭菌CMCC(B)220519，均購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。

1.4 培養(yǎng)基

試驗(yàn)中應(yīng)用了麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：07221101）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)：02221103）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：06221101）、胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基（ 批 號(hào)：02221101）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)：04221101）[8]、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)：03221103），這些均購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司；pH 7.0 氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液（批號(hào)：140424）以及含 0.2 mol 氯化鎂的 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液（批號(hào)：28221203）為實(shí)驗(yàn)室自配。

 

2.方  法

2.1 菌液制備

使用 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液將金黃色葡萄球菌工作菌株稀釋至不超過(guò)100 cfu/mL 的菌懸液，生孢梭菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌的制備方法相同 [9]。

2.2 微生物限度檢查用供試液的制備

稱(chēng)取 10 g 乳酸環(huán)丙沙星原料藥，用緩沖液稀釋至 100 mL，振搖后靜置，取上清液 10 mL，再次加入緩沖液至100 mL，制備成 1:100 的供試液，振搖后靜置，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)組

需氧菌組：用緩沖液潤(rùn)濕濾膜，吸取供試液 1 mL 進(jìn)行薄膜過(guò)濾，用緩沖液沖洗 5 次，每次沖洗量為 100 mL，最后一次沖洗液中加入 1 mL 金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌的菌懸液，過(guò)濾后取下濾膜，貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）中，進(jìn)行平行試驗(yàn) 2 份 [10] ：枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的處理方法相同。需氧菌的平皿在30 ～ 35 ℃環(huán)境中培養(yǎng)不超過(guò) 3 天；霉菌和酵母菌在 30 ～ 35 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)不超過(guò) 5 天。按薄膜過(guò)濾法測(cè)定菌數(shù)，并取平均值。3 批樣品分別進(jìn)行試驗(yàn)。

霉菌和酵母菌組：采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢驗(yàn)，操作與需氧菌組相同，最后一次沖洗液中加入 1 mL 白色念珠菌試驗(yàn)菌的菌懸液，過(guò)濾后取下濾膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）中，進(jìn)行平行試驗(yàn) 2 份；黑曲霉的處理方法相同。將以上平皿放置在 20 ～ 25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)不超過(guò) 5 天，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定菌數(shù)，并取平均值。3 批樣品分別進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3.2 供試品對(duì)照組

取“2.2”項(xiàng)下制備好的供試液，用 0.9% 無(wú)菌氯化鈉稀釋液代替菌液，其他操作與“2.3.1”項(xiàng)下相同。

2.3.3 菌液對(duì)照組

取稀釋液代替供試液，其他操作與“2.3.1”項(xiàng)下相同。

2.3.4 計(jì)算菌液對(duì)照組

回收率比值分別按下列公式進(jìn)行計(jì)算。

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)組

與需氧菌同樣采用薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)，最后一次沖洗液中加入 1 mL 大腸埃希菌試驗(yàn)菌的菌懸液，將濾膜轉(zhuǎn)移到 100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，30 ～ 35 ℃環(huán)境中培養(yǎng) 18 h ；取上述 1 mL 培養(yǎng)液接種到 100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ～ 44 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h ；將麥康凱液體的培養(yǎng)物進(jìn)行劃線接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，30 ～ 35 ℃環(huán)境中培養(yǎng) 18 h[11]。3 批樣品分別進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.2 陽(yáng)性對(duì)照組

取小于 100 cfu 大腸埃希菌菌液，依法按薄膜過(guò)濾法檢查，每次沖洗量為 100 mL，沖洗次數(shù)為 5 次，將濾膜轉(zhuǎn)至 100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他操作與試驗(yàn)組相同。

2.4.3 陰性對(duì)照組

取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 100 mL，30 ～ 35 ℃環(huán)境中培養(yǎng) 18 h ；其他操作與相應(yīng)控制菌試驗(yàn)組相同。

2.5 乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無(wú)菌方法適用性試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)組

取一次性使用全封閉式集菌培養(yǎng)器，過(guò)濾常規(guī)檢驗(yàn)量的乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液作為供試品組，用含 0.2 mol/L氯化鎂的 0.1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液進(jìn)行沖洗過(guò)濾 8 次，注入 100 mL 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，再加入 0.2 mol/L 無(wú)菌氯化鎂溶液 5 mL，接入金黃色葡萄球菌懸液 1 mL[12]。大腸埃希菌、生孢梭菌均同法操作。將以上培養(yǎng)基置于33 ℃的條件下培養(yǎng) 5 天；同法操作，白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌則注入 100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基后分別加入菌液 1 mL，將培養(yǎng)器置 23 ℃的條件下培養(yǎng) 5 天，逐日觀察記錄結(jié)果 [13]。3 批樣品分別進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5.2 陽(yáng)性對(duì)照組

取裝有相同體積培養(yǎng)基的容器，加入 0.2 mol/L 無(wú)菌氯化鎂溶液 5 mL，再接入等量的試驗(yàn)菌作為對(duì)照。6 種試驗(yàn)菌分別進(jìn)行無(wú)菌方法適用性試驗(yàn)，放置在規(guī)定的溫度中培養(yǎng) 5 天，每日觀察，記錄結(jié)果 [13]。

2.5.3 陰性對(duì)照組

以含 0.2 molL 氯化鎂的 0.1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液代替供試品，分別在過(guò)濾后向集菌培養(yǎng)器注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，再分別加入 0.2 mol/L 無(wú)菌氯化鎂溶液 5 mL作為陰性對(duì)照。

 

3.結(jié)  果

3.1 乳酸環(huán)丙沙星需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì) 3 批乳酸環(huán)丙沙星原料藥的計(jì)算分析，結(jié)果顯示 5 種試驗(yàn)菌株的回收率比值均在 0.5 ～ 2 的范圍內(nèi)，這表明所采用的供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法適用于乳酸環(huán)丙沙星原料藥的微生物計(jì)數(shù)。詳細(xì)結(jié)果參見(jiàn)表1。

表1 各驗(yàn)證菌的回收率

 

3.2 乳酸環(huán)丙沙星大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

表 2 顯示，在 3 批乳酸環(huán)丙沙星樣品的陰性對(duì)照組中未檢出大腸埃希菌，而試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組中均檢出大腸埃希菌。因此，可以采用本方法對(duì)乳酸環(huán)丙沙星原料藥進(jìn)行大腸埃希菌的檢查。表 2 中“+”表示培養(yǎng)液渾濁，有菌生長(zhǎng)，“－”表示培養(yǎng)液澄清，無(wú)菌生長(zhǎng)，后續(xù)表格中相同。

表2 大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

 

3.3 乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無(wú)菌驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)表 3 的驗(yàn)證結(jié)果，對(duì) 3 個(gè)批次的乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液樣品進(jìn)行薄膜過(guò)濾法過(guò)濾后，所有試驗(yàn)菌均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)良好。與對(duì)照組相比，供試品組菌液濁度無(wú)明顯差異，生長(zhǎng)狀況良好，因此可以使用此方法進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。這表明在該條件下乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無(wú)抑菌作用，該方法適用于乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無(wú)菌檢查。

表3 無(wú)菌驗(yàn)證結(jié)果

 

4.討  論

 

注射用乳酸環(huán)丙沙星是一種廣譜抗菌劑，也是較早投入臨床應(yīng)用的喹諾酮類(lèi)藥物之一，尤其對(duì)需氧革蘭氏陰性菌感染表現(xiàn)出良好的療效。由于其價(jià)格低廉且療效顯著，因此在臨床實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用。本文按照《中國(guó)藥典》2020 年版的四部通則，確定了乳酸環(huán)丙沙星原料藥的微生物限度檢查方法以及乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射劑的無(wú)菌檢查方法。乳酸環(huán)丙沙星及其制劑具有一定的抑菌性，通過(guò)薄膜過(guò)濾法可以有效去除藥物的抑菌性，從而提高檢驗(yàn)的效率與準(zhǔn)確性 [14-15]。

在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用 1 ：100稀釋級(jí)的乳酸環(huán)丙沙星供試液，以pH7.0 無(wú)菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液作為稀釋液和沖洗液，試驗(yàn)菌株回收率可以達(dá)到 50% ～ 200% 的要求，因此，可以使用此方法對(duì)乳酸環(huán)丙沙星原料藥進(jìn)行微生物學(xué)限度檢查。為了去除其制劑的抑菌性，采用了含 0.2 mol/L 氯化鎂的 0.1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液進(jìn)行沖洗，并加入 0.2 mol/L 無(wú)菌氯化鎂溶液5 mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)該方法可以中和其抑菌作用，因此可以使用此檢查方法對(duì)乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液進(jìn)行無(wú)菌檢查。

 

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本文作者梁思華，廣東大翔制藥有限公司，僅供交流學(xué)習(xí)。