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隨著我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥逐漸得到世界的認(rèn)可。其中，中藥以其充足的資源、獨(dú)特的療效、微弱的不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，在保護(hù)人類健康方面具有重要作用[1]。中藥材作為中藥產(chǎn)業(yè)的核心資源，其質(zhì)量安全已受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。中藥材主要分為植物類、動(dòng)物類和礦物類3類，其中植物類中藥材占比達(dá)87%[2]。中藥材在種植、采收、貯存及加工等一系列過(guò)程中，均可能受到真菌污染產(chǎn)生真菌毒素，如苦杏仁因其富含油脂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易受到真菌污染[3]。真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的天然有毒化合物，主要包括黃曲霉毒素類（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素類（ochratoxin，OT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和伏馬毒素（fumonisin，F(xiàn)B）類等[4]，其中常見的真菌毒素見表1和圖1[5]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明中藥材容易受到AF[6]、OT[7]、ZEN[8]和DON[9]等真菌毒素的污染，如何保證中藥材質(zhì)量安全已成為中醫(yī)藥行業(yè)亟需解決的重大難題。真菌毒素往往會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生肝腎毒性，具有致癌、致畸、致突變等毒害作用[10]。為保障中藥生產(chǎn)質(zhì)量和用藥安全，建立合適的中藥材中真菌毒素前處理方法、檢測(cè)與脫毒技術(shù)尤為重要。本文就中藥材中真菌毒素的前處理方法、檢測(cè)技術(shù)及真菌毒素的降解3方面進(jìn)行綜述，為中藥材的質(zhì)量安全提供保障和參考。

 

 

 

1 真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)

 

《歐洲藥典》（EP10.0）與《英國(guó)藥典》對(duì)植物藥的限量標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，規(guī)定AFB1的限量為2.00 µg/kg，總AF為4.00 µg/kg[11-12]。《韓國(guó)藥典》規(guī)定甘草、決明子、桃仁、半夏、柏子仁、檳榔、山棗仁、遠(yuǎn)志、紅花、瓜蔞仁、龜甲、木瓜、白扁豆、蓮子肉、郁金、肉豆蔻、枳椇子、巴豆、苦杏仁中AFB1的限量為10.00 µg/kg[13]?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠(yuǎn)志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎、九香蟲、土鱉蟲、馬錢子、延胡索、陳皮、胖大海、桃仁、蜂房、酸棗仁、僵蠶24種中藥材中AFB1限量為5.00 µg/kg，總AF為10.00 µg/kg，規(guī)定薏苡仁含ZEN不得過(guò)500 μg/kg[14]。國(guó)外對(duì)真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)制定較早，但所包含的中藥材種類十分有限，目前國(guó)內(nèi)對(duì)中藥材限量標(biāo)準(zhǔn)體系日益完善，控制力度與手段都將與國(guó)際接軌。不同國(guó)家地區(qū)對(duì)中藥材中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)見表2。

 

2. 樣品前處理

 

樣品前處理主要包括提取和凈化2部分，提取方法主要有高速均質(zhì)提取法、振蕩提取法、超聲提取法、攪拌提取法等[18]，表3總結(jié)了真菌毒素檢測(cè)常見提取方法的特點(diǎn)及應(yīng)用。鑒于提取方法操作簡(jiǎn)單，在真菌毒素提取過(guò)程中應(yīng)用較為成熟，本文重點(diǎn)總結(jié)真菌毒素的凈化方法，通過(guò)凈化達(dá)到對(duì)真菌毒素的富集，以便定性定量分析中藥材中真菌毒素的污染情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材中真菌毒素的檢測(cè)與控制。以下從常規(guī)方法與新技術(shù)新方法2方面進(jìn)行闡述總結(jié)。

 

 

 

2.1常規(guī)方法

 

2.1.1  固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）凈化法 SPE凈化法是目前最為常用的真菌毒素前處理方法之一。通過(guò)建立SPE聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UHPLC- MS/MS）技術(shù)，檢測(cè)檳榔及其加工產(chǎn)品中的真菌毒素，發(fā)現(xiàn)檳榔中常見的真菌毒素為AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1[22]。占麗琴等[23]基于Poly-SeryHLB SPE柱，建立UHPLC-MS/MS法，檢測(cè)蓮子中10種真菌毒素，為蓮子的安全使用提供有效依據(jù)。Wang等[24]比較了基于固液萃取-SPE法和QuEChERS 2種前處理方法，建立了超快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-fast liquid chromatography tandem mass spectrometry，UFLC-MS/MS）檢測(cè)黃芪根中21種真菌毒素，發(fā)現(xiàn)新鮮黃芪中含青霉酸，發(fā)霉黃芪中含OTA和OTB。SPE凈化法快速高效、成本低，也應(yīng)用于使君子、薏苡仁[25-26]等中藥材中真菌毒素的富集。

 

2.1.2  QuEChERS法 QuEChERS法兼具快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、堅(jiān)固、安全等優(yōu)點(diǎn)，常被作為前處理方法進(jìn)行中藥材的凈化與富集。Zhao等[27]基于改進(jìn)的QuEChERS萃取和基質(zhì)分散固相萃?。╩atrix solid-phase dispersion，MSPD）的樣品前處理方法，利用UHPLC-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-triple quadrupole tandem mass spectrometry，UHPLC-QQQ-MS/MS）對(duì)肉豆蔻及其相關(guān)產(chǎn)品共45批樣品中的21種真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中4批樣品被AF污染。另外，通過(guò)QuEChERS的前處理方法，利用UFLC-MS/MS、UHPLC-四極桿串聯(lián)離子阱復(fù)合質(zhì)譜法（UHPLC-Q-Trap-MS）可分別檢測(cè)到當(dāng)歸中的AFB1、AFG1與肉豆蔻中的AFB1[28-29]。基于改進(jìn)的QuEChERS法和UHPLC-MS/MS同時(shí)分析地龍中22種真菌毒素，并發(fā)現(xiàn)FB1和FB2，為動(dòng)物類中藥材中真菌毒素的檢測(cè)提供了參考借鑒[30]。QuEChERS法可同時(shí)提取多種真菌毒素，尤其在食品方面應(yīng)用較多，如香菇、燕麥、谷物[31-34]等。QuEChERS法兼具提取與凈化的效果，可以對(duì)多種真菌毒素同時(shí)提取，在中藥材及食品等領(lǐng)域真菌毒素前處理方面發(fā)揮重要作用。

 

2.1.3  免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC）凈化法  IAC技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但是價(jià)格昂貴、重復(fù)利用率低，不利于進(jìn)行真菌毒素的大規(guī)模檢測(cè)。目前，IAC凈化法已成功應(yīng)用于“藥食同源”中藥材麥芽、干姜、甘草等[35-36]，相較于根及根莖類中藥材，該法對(duì)于動(dòng)物類中藥材應(yīng)用較少。目前已有研究基于IAC、多重真菌毒素IAC與特異性IAC的前處理方法，結(jié)合HPLC與HPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)馬錢子、蟬蛻、川芎、山藥、桔梗等中藥材中的真菌毒素[6,37-38]。Liu等[39]通過(guò)IAC凈化處理后，建立了一種靈敏、快速的HPLC-柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)技術(shù)（HPLC-post-column photochemical derivatization-fluorescence detection，HPLC-PCD-FLD），用于同時(shí)測(cè)定不同類型的玫瑰茄樣品中的AFs，該方法克服了玫瑰茄的高酸度和復(fù)雜成分的檢測(cè)困難，為其他類型高酸度中藥基質(zhì)提供參考。該技術(shù)以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，專屬性強(qiáng)、應(yīng)用范圍較廣，在中藥材真菌毒素的富集方面發(fā)揮著重要作用。

 

2.1.4  多功能凈化柱（multi-functional purification column，MFC）法  MFC是一種特殊的SPE柱，MFC與IAC相比，無(wú)需進(jìn)行活化、上樣和洗脫等繁瑣的步驟，處理方法更為簡(jiǎn)單快速。李海暢等[40]采用MFC并建立了UHPLC-MS/MS法，檢測(cè)中藥材中的8種真菌毒素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1、AFB2及ZEN等8種真菌毒素的線性關(guān)系良好，加樣回收率為72.1%～92.8%。采用Mycosep 226 MFC對(duì)薏苡仁、人參進(jìn)行前處理，采用TC-M160 MFC對(duì)白芍進(jìn)行前處理，結(jié)合LC-MS/MS與HPLC-PCD-FLD分析技術(shù)可檢測(cè)樣品被污染情況[41-42]。此外，在食品領(lǐng)域MFC的應(yīng)用多于在中藥材領(lǐng)域，如面制品、乳制品及調(diào)味醬[43-46]等。由于MFC無(wú)法同時(shí)對(duì)多種真菌毒素進(jìn)行凈化，且回收率相對(duì)較低，故在中藥材中應(yīng)用較少。

 

2.1.5  凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法  GPC與其他前處理凈化方法相比，該方法耗時(shí)耗力，且溶劑消耗量大，不利于經(jīng)濟(jì)節(jié)約。Zhao等[47]采用酸輔助液液萃取和GPC的前處理方法獲得較高濃度的OTA和OTB，結(jié)合HPLC/紫外分光光度-質(zhì)譜的檢測(cè)方法對(duì)OTA和OTB進(jìn)行分析，為OTA和OTB的富集和檢測(cè)提供了參考，但該法分離不完全，不適用于中藥材中真菌毒素的凈化。

 

2.2新技術(shù)、新方法

 

2.2.1  MSPD  MSPD操作簡(jiǎn)單、快速廉價(jià)，常應(yīng)用于固體、半固體和黏性樣品的處理。肉豆蔻作為香料和傳統(tǒng)藥物，易受真菌和真菌毒素的污染，通過(guò)QuEChERS和MSPD聯(lián)用技術(shù)對(duì)肉豆蔻及其相關(guān)產(chǎn)品的前處理，應(yīng)用UHPLC-QQQ-MS/MS法進(jìn)行真菌毒素檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有4批樣品被黃曲霉污染[27]。劉瑜等[48]建立了UHPLC-Q-Trap-MS法，通過(guò)比較QuEChERS、HLB-SPE柱和MLJ-1多重基質(zhì)吸附型SPE柱的3種前處理方法，最終確定MLJ-1多重基質(zhì)吸附型SPE柱法對(duì)7種真菌毒素的回收率較高，并用于人參、黃芪等中藥材中真菌毒素的檢測(cè)。采用UHPLC-MS/MS與磁性SPE吸附劑Fe3O4@PDA/MIL-101(Cr) 聯(lián)用技術(shù)，成功建立了甘草提取物中5種常見真菌毒素的分離純化方法，揭示了復(fù)雜基質(zhì)樣品中真菌毒素測(cè)定的潛在應(yīng)用前景[49]。MSPD新技術(shù)的出現(xiàn)，為中藥材中前處理技術(shù)的開發(fā)提供了新思路，為中藥材中真菌毒素的提取技術(shù)開辟了新方法。

 

2.2.2  分子印跡固相萃?。╩olecularly imprinted solid phase extract，MISPE）法  MISPE的出現(xiàn)為中藥材中真菌毒素前處理技術(shù)提供了新方向，目前極少發(fā)現(xiàn)該法用于中藥材中真菌毒素的凈化。通過(guò)開發(fā)目標(biāo)物結(jié)構(gòu)類似物槲皮素的虛擬模板，沉淀聚合法合成對(duì)ZEN具有特異性吸附的聚合物，可作為實(shí)際樣品的檢測(cè)方法[50]。Cao等[51-52]建立了一種以分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）為選擇性SPE吸附劑的UHPLC-FLD法測(cè)定生姜中OTA的方法，檢測(cè)出20批生姜樣品中6批被OTA污染。與IAC相比，MIP-SPE在保證回收率的同時(shí)，極大節(jié)約了檢測(cè)成本，該法在生姜中檢測(cè)OTA的成功應(yīng)用，為今后中藥材中真菌毒素檢測(cè)的前處理方法提供了發(fā)展前景。

 

2.2.3  免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）技術(shù)  IMBs技術(shù)以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，近年來(lái)，逐漸用于真菌毒素檢測(cè)的前處理過(guò)程，但在中藥中應(yīng)用較少[42]。李夢(mèng)華[42]建立了IMBs-UHPLC-FLD相結(jié)合的方法用于山藥中AFB1的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2批山藥樣品被AFB1污染，且通過(guò)UFLC-MS/MS驗(yàn)證排除假陽(yáng)性干擾。此外，基于UHPLC法，開發(fā)AFB1、AFB2、AFG1和AFG24種AF的新型IMBs富集凈化的前處理技術(shù)可用于中藥材陳皮中真菌毒素的檢測(cè)[53]。IMBs技術(shù)具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、再生性好的特點(diǎn)，為中藥材的前處理方法開辟了新道路。

 

各類凈化方法的特點(diǎn)及其應(yīng)用見表4。

 

 

3.真菌毒素的分析檢測(cè)

 

對(duì)于建立中藥材中真菌毒素的監(jiān)測(cè)體系而言，準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)是保證中藥材質(zhì)量安全的重點(diǎn)。當(dāng)前，液相色譜（liquid chromatography，LC）和氣相色譜（gas chromatography，GC）與特定檢測(cè)器耦合是獲得高準(zhǔn)確度結(jié)果常用的技術(shù)，其中，LC/FLD是使用較為廣泛的檢測(cè)真菌毒素的方法；LC-MS或UHPLC-MS是分析檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中多類別痕量真菌毒素最有力工具之一[54]。

 

3.1 常規(guī)檢測(cè)

 

3.1.1  薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）  TLC由于檢測(cè)成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的需求較少，有時(shí)被用于篩選中藥中的真菌毒素[55-56]。但其提取物容易含有較多雜質(zhì)，前處理過(guò)程繁瑣，專屬性和靈敏度較差，目前應(yīng)用較少。錢維清等[57]采用TLC法對(duì)龍膽瀉肝丸等27個(gè)品種中成藥中AFB1進(jìn)行檢測(cè)，得到其最低檢測(cè)濃度為5 ng/g，其靈敏度差且工作量大，不適合復(fù)雜基質(zhì)中成藥中真菌毒素的含量測(cè)定。

 

3.1.2  HPLC法 隨著對(duì)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性要求的不斷提高，HPLC法已逐漸成為真菌毒素分析檢測(cè)的常用方法，在當(dāng)歸、百合、山茱萸、五味子、薏苡仁、生姜等中藥的真菌毒素檢測(cè)中均有應(yīng)用[58-59]。FLD是HPLC檢測(cè)真菌毒素最常用的檢測(cè)器，一些不含發(fā)色團(tuán)的真菌毒素或熒光較弱的毒素通常需要衍生化處理，包括柱前和柱后衍生，應(yīng)用較多的是光化學(xué)柱后衍生法[60]。此外，HPLC耦合紫外檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的研究也有報(bào)道[61]。一種基于超聲波輔助固液萃取和IAC凈化結(jié)合HPLC-PCD- FLD的分析方法被開發(fā)用于13批肉豆蔻樣品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA的同時(shí)測(cè)定[59]，該法專屬性和精密度良好，檢測(cè)限和定量限分別可達(dá)到0.02～0.25、0.06～0.80 μg/kg，為復(fù)雜基質(zhì)中多種真菌毒素的同時(shí)測(cè)定提供了方法參考。雖然與AF和OTA相比，其他真菌毒素研究較少，但使用HPLC-DAD/FLD測(cè)定中藥中的DON、ZEN和展青霉素（patulin，PAT）等也有報(bào)道[62]。此外，通過(guò)相應(yīng)的前處理方法后HPLC法在基質(zhì)更為復(fù)雜的中成藥中也有應(yīng)用，如坤寶丸、人參歸脾丸、骨折挫傷膠囊中AF和OTA的測(cè)定[63-65]。隨著UHPLC的快速發(fā)展，色譜儀的分辨率和靈敏度顯著提高，分析周期明顯縮短，Wen等[66]采用UHPLC-FLR僅用10 min就實(shí)現(xiàn)了生姜和其他相關(guān)樣品中真菌毒素的靈敏檢測(cè)。由于中藥體系復(fù)雜，分析物的保留時(shí)間可能會(huì)受樣品基質(zhì)的干擾導(dǎo)致識(shí)別不準(zhǔn)確，通常需要使用質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)。HPLC/UHPLC與FLR或紫外檢測(cè)器在中藥中進(jìn)行真菌毒素分析通常需要樣品前處理過(guò)程有較好的選擇性，極大縮小了其應(yīng)用范圍，在同時(shí)檢測(cè)多類別的真菌毒素應(yīng)用方面弱于LC-MS法。

 

3.1.3  GC法 GC檢測(cè)真菌毒素具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，通常用于分析分子結(jié)構(gòu)中不含發(fā)色團(tuán)，或具有弱熒光或弱吸收的真菌毒素[55]。Kong等[67]建立了GC-電子捕獲檢測(cè)器的方法，用于89種中藥材和10種不同來(lái)源的相關(guān)產(chǎn)品中T-2和HT-2毒素的同時(shí)測(cè)定，檢測(cè)限分別為1.88和0.47 ng/g，回收率超過(guò)85%，相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，并采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的驗(yàn)證。該法同樣適合于中藥及相關(guān)產(chǎn)品中嘔吐毒素的檢測(cè)，具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度[68]。但是，大多數(shù)真菌毒素是非揮發(fā)性物質(zhì)，需要衍生化將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，使GC分析真菌毒素存在很大限制。

 

3.1.4  LC-MS法  LC-MS是最權(quán)威的檢測(cè)技術(shù)[54]。LC-MS/MS可以同時(shí)提供目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和分子結(jié)構(gòu)信息，檢測(cè)快速、靈敏準(zhǔn)確、對(duì)前處理過(guò)程要求低、適合多類別真菌毒素分析、可同時(shí)定性定量[54]。《中國(guó)藥典》2020年版記載的毒素檢測(cè)方法中，LC-MS/MS法檢測(cè)毒素種類最多，應(yīng)用最廣泛[20-21,69]。LC/MS-MS技術(shù)在多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)方面已經(jīng)有很多研究報(bào)道，如三七中的26種真菌毒素[70]、瓜蔞皮中的22種真菌毒素[71]、黃芪和肉豆蔻中21種真菌毒素[24,27]和6種藥食同源種子類中藥中的31種真菌毒素[72]的檢測(cè)。需要特別關(guān)注的是基質(zhì)效應(yīng)可影響LC-MS/MS定量的準(zhǔn)確度，當(dāng)前主要通過(guò)基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法和同位素內(nèi)標(biāo)檢測(cè)等手段來(lái)克服中藥材中復(fù)雜多樣的化學(xué)成分引起的基質(zhì)效應(yīng)[69,73-74]，以實(shí)現(xiàn)中藥材中真菌毒素的高通量檢測(cè)?；贚C-MS的真菌毒素含量測(cè)定方法，通常采用QQQ-MS法，選擇多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，已有研究表明采用LC-MS/MS進(jìn)樣1針即可實(shí)現(xiàn)在中藥材中多達(dá)35種不同毒素的含量測(cè)定[75]。此外，也可通過(guò)線性離子阱質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、FB1和FB2的測(cè)定[76]，但其缺點(diǎn)是分辨率低，通常只聚焦于檢測(cè)AF類、FB類、單端孢霉烯類、OT類等常見的真菌毒素，無(wú)法實(shí)現(xiàn)未知化合物的檢測(cè)。此外，高分辨質(zhì)譜正在成為未來(lái)檢測(cè)真菌毒素的強(qiáng)有力工具，其選擇性明顯增強(qiáng)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶向和非靶向分析。由于其精確的質(zhì)量鑒別能力，可對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的化合物進(jìn)行定性，特別適合于新型真菌毒素、隱蔽型真菌毒素、真菌毒素的代謝物的檢測(cè)等[77-78]。近年來(lái)，隨著高分辨率質(zhì)譜的應(yīng)用增加，在大規(guī)模篩選檢測(cè)不同類型樣品中的真菌毒素方面展示出巨大的潛力[75,79-81]。

 

3.2 快檢

 

中藥材在種植、采收、儲(chǔ)存和加工的各個(gè)過(guò)程中都易感染真菌毒素，因此，為了更好地監(jiān)測(cè)中藥材的質(zhì)量，便捷快速的檢測(cè)方法必不可少。這種檢測(cè)方法可以在短時(shí)間內(nèi)獲取較為準(zhǔn)確的結(jié)果，從而及時(shí)發(fā)現(xiàn)和解決中藥材質(zhì)量問(wèn)題。目前快速篩選法主要包括酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金標(biāo)記技術(shù)（gold immunochromatography assay，GICA）及生物傳感器等。

 

3.2.1  ELISA法  ELISA是快速檢測(cè)和初步定量真菌毒素的重要工具之一，《中國(guó)藥典》2020年版通則<2351>AF的第3法即為ELISA法。該方法適用于大批量的快速篩選，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本相對(duì)較低，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求不高，此外，由于抗體對(duì)抗原具有高度的特異性識(shí)別，因此樣品通常不需要復(fù)雜的預(yù)處理，并且易于操作[82]。但ELISA的重復(fù)性仍需提高，檢測(cè)結(jié)果存在假陽(yáng)性、不能準(zhǔn)確定量。目前已建立了用于不同中藥材中AFs檢測(cè)的ELISA方法，特異性識(shí)別AFB1[83-84]或AFB1、B2、G1、G2總量[85-86]。南鐵貴等[87]運(yùn)用ELISA法對(duì)經(jīng)過(guò)液液萃取前處理的麥芽、酸棗仁、桃仁、薏苡仁進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AFB1和總量與HPLC法一致。此外，也有采用ELISA法檢測(cè)薏苡仁中嘔吐毒素的報(bào)道[88]，檢測(cè)結(jié)果與UHPLC-MS的相關(guān)性良好，操作更為簡(jiǎn)便?；诟咄靠鞕z的優(yōu)勢(shì)，ELISA法可以從源頭環(huán)節(jié)及時(shí)篩查中藥中真菌毒素污染情況，常用于定性分析和前期初篩，應(yīng)用前景良好[89]。

 

3.2.2  GICA  GICA具有操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好、成本低、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[90-92]。Zhang等[8]采用免疫層析試紙條對(duì)AFB1、ZEN、T-2毒素等真菌毒素進(jìn)行篩選，采用抗體/納米金顆粒偶聯(lián)的方法進(jìn)行了pH、單克隆抗體濃度和抗原量的優(yōu)化，在檢測(cè)的30份藥品和食品樣品中，2份酸棗仁樣品呈陽(yáng)性，經(jīng)HPLC法和ELISA法驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果一致，證實(shí)該方法可用于藥品和食品貯藏場(chǎng)所真菌毒素的快速篩選和同時(shí)檢測(cè)。GICA法已應(yīng)用于酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、決明子和遠(yuǎn)志等中藥材[93]，地龍、決明子、延胡索、土鱉蟲、馬錢子等中藥飲片[94]和牛黃鎮(zhèn)驚丸等中成藥[95]中，但對(duì)真菌毒素殘留量的檢測(cè)多集中于AFB1和AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的總量。然而，該方法在檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，常出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題，其次檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性不高。GICA法對(duì)操作人員沒(méi)有專業(yè)技能要求，無(wú)需大型儀器設(shè)備，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得測(cè)試結(jié)果，檢測(cè)成本較低，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)大量中藥材中的真菌毒素。

 

3.2.3  生物傳感器  光學(xué)生物傳感器具有專屬性強(qiáng)、響應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于中藥材復(fù)雜基質(zhì)中低豐度真菌毒素的快速檢測(cè)[96-98]。特別是新型納米材料的應(yīng)用，極大提高了檢測(cè)靈敏度。Wu等[99]運(yùn)用新型無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器在核酸外切酶和DNA-AgNCs的輔助下進(jìn)行3重循環(huán)放大用于AFB1的檢測(cè)，AFB1可以進(jìn)行連續(xù)3個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，使傳感器具有較低的檢測(cè)限和較寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，基于適配體與靶標(biāo)的高效特異性結(jié)合能力，可以顯著降低傳統(tǒng)檢測(cè)方法中干擾成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。然而，大多數(shù)適配體僅針對(duì)單一污染物，目前已經(jīng)構(gòu)建的適配體有AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN[96,100]。張楠[101]開發(fā)了一種基于氧化石墨烯和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的“turn-on”型熒光適配體傳感器，用于定量檢測(cè)薏苡仁中PAT與ZEN，實(shí)現(xiàn)了雙真菌毒素高效經(jīng)濟(jì)的同時(shí)檢測(cè)。一項(xiàng)高效、靈敏的比率型熒光適配體傳感器用于蓮子中PAT的檢測(cè)，其檢測(cè)限更為靈敏，為復(fù)雜基質(zhì)中藥中真菌毒素的檢測(cè)提供了方法借鑒。電化學(xué)生物傳感器具有特異性好、靈敏度高、成本低、可控性強(qiáng)、分析速度快、耗時(shí)短等突出優(yōu)勢(shì)，尤其適用于真菌毒素等小分子物質(zhì)的痕量檢測(cè)[102-103]。Sun等[104]制備了一種用于麥芽樣品中OTA超靈敏檢測(cè)的綠色電化學(xué)免疫傳感器，與其他直接或一次性電化學(xué)免疫傳感器相比，所研制的免疫傳感器在0.1～1.0 ng/mL對(duì)OTA的檢出限（0.08 ng/mL）較低。Jia等[105]建立了一種基于CdSe@CdS量子點(diǎn)的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器，用于百合和大黃樣品中OTA的快速分析，由于適配體對(duì)OTA的特異性識(shí)別和捕獲能力，在多種干擾物質(zhì)存在下電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器對(duì)OTA仍表現(xiàn)出高特異性，為食藥安全評(píng)價(jià)中更多真菌毒素的檢測(cè)提供了新的通用分析工具。雖然已經(jīng)開發(fā)出了大量的電化學(xué)免疫傳感器，但應(yīng)用于中藥基質(zhì)的真菌毒素傳感器的研究相對(duì)較少。此外，傳感器的穩(wěn)定性和可重復(fù)性仍有待提高；大部分電化學(xué)生物傳感器只能檢測(cè)一種毒素，還不能滿足同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的實(shí)際需求。尋找具有更多樣化和復(fù)雜性能的新型材料仍是開發(fā)電化學(xué)生物傳感器的未來(lái)發(fā)展方向。

 

3.2.4  其他  隨著光譜技術(shù)和電子技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，近紅外技術(shù)得到了很大程度的提高，因此將紅外熒光碳量子點(diǎn)作為檢測(cè)探針，已成為最有效的有機(jī)物質(zhì)定量定性分析技術(shù)之一[106]。毛細(xì)管電泳技術(shù)融合了HPLC和常規(guī)電泳的優(yōu)點(diǎn)，具有快速、自動(dòng)、有效分析復(fù)雜成分的優(yōu)點(diǎn)。李銘慧等[107]建立了在線現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)增堆積毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法，并將該方法應(yīng)用于薏苡仁中OTA和桔霉素的分析檢測(cè)。流體微球技術(shù)具有所需樣品容量小、分析時(shí)間短、檢測(cè)成本低，并可同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，適合于現(xiàn)場(chǎng)中藥材的快速篩查[108]。一種基于間接競(jìng)爭(zhēng)原理的流式微球技術(shù)成功應(yīng)用于麥芽中OTA的檢測(cè)，該法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、可靠[108]。此外，基于納米粒子生物條形碼技術(shù)的AFB1痕量分析方法成功應(yīng)用于決明子、遠(yuǎn)志、柏子仁3種不同的中藥材中，檢出限可達(dá)到1×10–8ng/mL，可能是未來(lái)AFB1檢測(cè)的有力方法[109]。電子鼻通過(guò)評(píng)估真菌次生代謝產(chǎn)物的理化性質(zhì)，基于固態(tài)傳感器檢測(cè)污染樣品釋放的揮發(fā)性成分。每種樣品都能產(chǎn)生獨(dú)特的“指紋”，以其味道和香味為特征，對(duì)特征氣味的檢測(cè)可以提供有關(guān)樣品所產(chǎn)生代謝物類別的初步信息[110-111]。

 

4. 真菌毒素的降解

 

真菌毒素種類繁多，且與生命健康密切相關(guān)，因此降低真菌毒素的殘留量至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在真菌毒素降解方面作了大量研究，降解方法主要分為物理、化學(xué)和生物降解3大類。

 

4.1物理降解

 

物理降解法主要是通過(guò)改變外部環(huán)境條件或利用物理射線對(duì)真菌毒素進(jìn)行降解，常見的物理降解方法包括高溫降解法、吸附法和輻射法等。真菌毒素具有熱穩(wěn)定性，需通過(guò)較高的溫度處理才能破壞其分子結(jié)構(gòu)。高溫加熱可降解大部分真菌毒素，但同時(shí)中藥材中的蛋白質(zhì)、氨基酸等也會(huì)被破壞[112]，因此其應(yīng)用范圍狹小。吸附法是目前應(yīng)用最廣泛的方法，其原理是利用吸附劑（如納米制品、蒙脫石或活性炭等）與真菌毒素結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，從而達(dá)到降解真菌毒素的目的。吸附劑對(duì)于真菌毒素的吸附主要依靠氫鍵、離子鍵等[113]，活性炭因比表面積大且價(jià)格低廉被廣泛應(yīng)用。吸附法對(duì)樣品幾乎沒(méi)有影響，是一種綠色安全的手段。輻射法是通過(guò)γ射線、電子束及紫外線照射，破壞真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到降解的目的。該法操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。Nurtjahja等[114]通過(guò)射線輻照發(fā)現(xiàn)肉豆蔻中AFB1含量降低，黃曲霉菌群總數(shù)下降。輻射法是最有潛力的降解手段之一，但是在大規(guī)模生產(chǎn)中需考慮成本問(wèn)題。

 

4.2 化學(xué)降解

 

化學(xué)降解法是通過(guò)添加化學(xué)試劑破壞真菌毒素的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降解為毒性低的物質(zhì)。常見的化學(xué)降解法包括有機(jī)酸降解、氨化降解、臭氧降解。有機(jī)酸可與真菌毒素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)從而降低毒性，降解能力強(qiáng)，但是有機(jī)酸殘留可能會(huì)損害人類及動(dòng)物的生命健康，并且效率低。氨化降解主要是利用氨水反應(yīng)或氨氣熏蒸等方式使真菌毒素的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而降低毒性[115]。該法降解效果良好，是最先進(jìn)、經(jīng)濟(jì)可行的方法，可用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)，但是對(duì)環(huán)境有一定的影響。臭氧具有很強(qiáng)的氧化能力，可以氧化真菌毒素并產(chǎn)生無(wú)毒的產(chǎn)物；該法由于綠色環(huán)保而倍受青睞，但是臭氧具有微毒性，大規(guī)模應(yīng)用會(huì)受到限制，并且制備成本較高。

 

4.3生物降解

 

微生物的細(xì)胞壁可以吸附真菌毒素形成復(fù)合體，進(jìn)而使毒素的生物利用度降低。微生物吸附法具有特異性強(qiáng)、環(huán)保和高效的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。微生物法降解真菌毒素已經(jīng)逐漸成熟，多種微生物具有顯著降解作用，如枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌等[116]。此法不易對(duì)環(huán)境造成污染，是一種綠色安全的降解手段，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，該方法可有效地控制真菌毒素的污染。

 

中藥材中真菌毒素檢測(cè)分析研究策略見圖2。

 

 

5.結(jié)語(yǔ)與展望

 

真菌毒素種類多、毒性強(qiáng)、分布廣，可通過(guò)各種渠道污染中藥材、食品及農(nóng)作物，嚴(yán)重威脅生命健康，因此有必要建立特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法及長(zhǎng)效監(jiān)測(cè)機(jī)制。本文重點(diǎn)綜述了真菌毒素的前處理、檢測(cè)及降解脫毒方法。對(duì)于復(fù)雜樣品的前處理技術(shù)，傳統(tǒng)的提取凈化方法逐步被取代，多種凈化技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用是目前的研究熱點(diǎn)，未來(lái)真菌毒素的前處理技術(shù)應(yīng)該朝著自動(dòng)化與高通量分析的方向發(fā)展。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)及電子科學(xué)的發(fā)展，真菌毒素的檢測(cè)方法也不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的儀器分析技術(shù)雖然具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問(wèn)題，如不能即時(shí)檢測(cè)、樣品前處理復(fù)雜繁瑣及對(duì)儀器操作人員要求高等?？鞕z雖然能實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速篩查，但是其準(zhǔn)確性需進(jìn)一步提高，開發(fā)更加靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為新的挑戰(zhàn)與趨勢(shì)。建立真菌毒素廣譜篩查技術(shù)可對(duì)真菌毒素進(jìn)行初步篩查，能夠?qū)崿F(xiàn)真菌毒素的污染預(yù)警，只有早期檢測(cè)到中藥材中的真菌毒素并控制干預(yù)，才能保障人民的生命健康。對(duì)于真菌毒素的降解，與物理和化學(xué)降解方法相比，生物降解法更加安全高效、綠色環(huán)保，是未來(lái)研究的方向。中藥材中真菌毒素的快速、準(zhǔn)確測(cè)定及降解是保證中藥有效性和安全性的關(guān)鍵，也是推動(dòng)中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化的重要保障。