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1. 實(shí)驗(yàn)原理

巨噬細(xì)胞身為機(jī)體免疫系統(tǒng)里的關(guān)鍵“守衛(wèi)軍”，肩負(fù)著吞噬病原體、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以及維持組織穩(wěn)態(tài)諸多重任。通過原代提取的方式，研究人員能夠繞開細(xì)胞系多次傳代后可能出現(xiàn)的遺傳特性改變、功能衰退這問題，直接從鮮活的生物體內(nèi)精準(zhǔn)抓取具備完整生物活性的巨噬細(xì)胞，為后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

原代骨髓來源的巨噬細(xì)胞在未受到刺激時，通常呈圓形或橢圓形，其細(xì)胞大小不一，細(xì)胞核較小，多呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)疏松，有明顯的核仁。細(xì)胞質(zhì)中常見到空泡和顆粒狀物質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的吞噬功能相關(guān)。

以下是以小鼠為例的巨噬細(xì)胞原代提取方法的詳細(xì)步驟和注意事項：

2. 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物：C57BL/J小鼠

試劑：含10%FBS DMEM高糖培養(yǎng)基、75%乙醇、無菌PBS。

實(shí)驗(yàn)器械：一次性注射器、手術(shù)器械、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 小鼠取腿骨

1）小鼠麻醉與處死：麻醉小鼠，迅速、人道地采用脫臼法處死，遵循動物實(shí)驗(yàn)倫理，減輕小鼠痛苦。

2）體表消毒：備好足量75%乙醇的燒杯，放入小鼠浸泡5min，充分消毒殺菌；隨后用干凈紙吸干體表多余酒精。

3）皮膚及關(guān)節(jié)處理：持消毒剪刀在小鼠背部剪一小口，徒手平穩(wěn)撕開皮膚至小腿關(guān)節(jié)，剔除足關(guān)節(jié)與皮膚。

4）腿部取材、二次消毒：用消毒剪刀小心從大腿根部大轉(zhuǎn)子處拆解后肢，避免骨折；剔除肌肉，將腿骨置于75%乙醇培養(yǎng)皿浸泡5min。

5）超凈臺準(zhǔn)備：5min到點(diǎn)，更換新乙醇培養(yǎng)皿，移入超凈臺，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)營造無菌條件。

3.2 BMDM細(xì)胞提取和誘導(dǎo)

1）腿骨預(yù)處理：將乙醇浸泡過的小鼠腿骨移至盛冷PBS的容器，浸沒腿骨，用PBS洗去骨表面乙醇，重復(fù)3次，確保洗凈。

2）骨髓吹出操作：分離洗凈的股骨、脛骨，消毒剪剪斷兩端；用1mL注射器吸取冷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對準(zhǔn)斷端吹骨髓，反復(fù)吹洗約3次，至腿骨內(nèi)無明顯紅色。

3）細(xì)胞分散與過濾篩選：用5mL移液槍輕柔吹打含骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)基，分散細(xì)胞團(tuán)塊；懸液過70μm細(xì)胞濾器，濾除雜質(zhì)，轉(zhuǎn)移至15mL離心管。

4）離心及重懸處理：1500rpm/min離心5min，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液重懸，靜置5min，再同轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清；用冷誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

5）細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基更換：按要求鋪板培養(yǎng)細(xì)胞，第三天換一半培養(yǎng)基，維持環(huán)境穩(wěn)定；第五天全換新鮮培養(yǎng)基，滿足細(xì)胞生長分化需求；第七天細(xì)胞達(dá)可用狀態(tài)。

4. 注意事項

1）BMDM細(xì)胞生物學(xué)特性特殊，不可傳代。

2）胰酶消化常用于分離貼壁細(xì)胞，但不適用于BMDM細(xì)胞。因其蛋白水解活性會破壞細(xì)胞膜、關(guān)鍵蛋白，致使細(xì)胞失活，無法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，切勿用胰酶處理。

3）因傳代、胰酶消化受限，取用BMDM細(xì)胞建議用細(xì)胞刮刀刮。

4）BMDM細(xì)胞脆弱、對環(huán)境敏感，獲取后宜直接鋪板用于實(shí)驗(yàn)，盡量別換培養(yǎng)容器。更換易造成物理擾動，引發(fā)細(xì)胞碰撞、拉扯，損傷細(xì)胞，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。