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1.通用測試方式（透析）

 

藥物、生長因子、外泌體這類活性物質(zhì)的體外釋放行為監(jiān)測均可通過透析法來檢測。具體如下：類似于圖1所示方法，釋放介質(zhì)可選擇PBS、生理鹽水等，通常將負(fù)載活性物質(zhì)的凝膠置于透析袋（PS:透析袋的截留分子量需大于活性物質(zhì)的分子量）內(nèi)，再將其浸于裝有釋放介質(zhì)的離心管中，也可直接將凝膠置于釋放介質(zhì)中。然后將透析裝置置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)模擬機體環(huán)境要求設(shè)置相應(yīng)參數(shù)（溫度、振蕩速度等）。在設(shè)定時間內(nèi)對釋放介質(zhì)取樣進行濃度測定，并補充相同體積、溫度和pH的釋放介質(zhì)，使釋放介質(zhì)的總體積保持不變。

 

圖1 透析法測試藥物負(fù)載型凝膠的藥物釋放行為[1]

 

2.藥物類檢測方法

 

1. OD值檢測法

若負(fù)載的藥物含有紫外、熒光吸收峰，可通過紫外光譜儀、熒光光譜儀、高效液相色譜儀（HPLC）等儀器計算釋放介質(zhì)中的濃度。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)計算藥物累積釋放率，并采用繪圖軟件繪制釋放曲線（PS:需首先建立目標(biāo)藥物濃度與儀器吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線）。

 

2. 電化學(xué)方法

藥物釋放行為檢測中，電化學(xué)方法提供了快速原位測量的可能性，同時避免了釋放介質(zhì)中未溶解分子的存在所造成的干擾。類似于圖2所示方法，可將負(fù)載藥物的凝膠置于三電極體系裝置中，原位實時監(jiān)測釋放介質(zhì)的藥物含量。如可利用方波伏安技術(shù)測定鹽酸阿霉素（DOX）的氧化還原反應(yīng)進而測試DOX的釋放行為[2]。缺點是不同電化學(xué)測試方法的技術(shù)靈敏度和響應(yīng)能力差別很大。此外，所使用的傳感器可能只針對特定的藥物[1]。

圖2 電化學(xué)測試DOX的釋放行為裝置圖[2]

 

3.生長因子類檢測方法

 

1. 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

釋放介質(zhì)中生長因子的定量檢測通常通過ELISA法實現(xiàn)，即對應(yīng)的生長因子試劑盒檢測釋放介質(zhì)中的目標(biāo)生長因子含量[3]。

 

4.外泌體檢測方法

 

1. 免疫染色法

如何可視化監(jiān)測水凝膠中負(fù)載的外泌體在釋放過程是否被細(xì)胞吞噬掉？可利用外泌體的本身結(jié)構(gòu)特性（具有脂質(zhì)雙層膜的微小囊泡）進行免疫著色后觀察。研究中常用PKH26外泌體紅色熒光標(biāo)記染料對外泌體進行熒光標(biāo)記，監(jiān)測細(xì)胞吞噬作用[4]。

 

圖3 PKH26熒光標(biāo)記外泌體在GelMA-PPY-Exosomes (GMPE)水凝膠及神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的可視化分布[4]

 

2. BCA法蛋白定量檢測

釋放介質(zhì)中外泌體的釋放曲線通常采用BCA（二奎啉甲酸）法進行測定[5]。簡要原理為在堿性環(huán)境下外泌體中的蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有較高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。

 

圖4 BCA法測試GelMA水凝膠中細(xì)胞外囊泡（sEVs）的釋放曲線[5]

 

3. 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

研究表明，幾種四跨膜蛋白，尤其是CD63、CD81和CD9被認(rèn)為是外泌體的標(biāo)志物[6]，因此可選用對應(yīng)的ELISA試劑盒進行定量測定外泌體的釋放曲線。

 

圖5 PKH67標(biāo)記GelMA凝膠中HUVECs-Exos及ELISA法測試GelMA水凝膠中Exos的釋放曲線[8]

 

下面，列舉一些在檢測活性物質(zhì)（藥物、生長因子、外泌體）的應(yīng)用實例。

 

1. Advanced Healthcare Materials：GelMA-β-環(huán)糊精基微針貼片用于遞送疏水藥物

研究材料：羧甲基β-環(huán)糊精、GelMA

目標(biāo)藥物：疏水性藥物-姜黃素

負(fù)載方式：姜黃素與環(huán)糊精的主客體包合作用

檢測方法：OD值檢測法，具體地，以VDPBS:DMSO=（4：1）為釋放介質(zhì)測試微針貼片中姜黃素的釋放行為，通過紫外光譜儀定期檢測釋放介質(zhì)中OD=430nm處的紫外吸收峰

研究結(jié)果：基于GelMA接枝β-環(huán)糊精的微針貼片。利用環(huán)糊精對疏水藥物的包載作用將抗癌藥物姜黃素負(fù)載到微針中，通過GelMA水凝膠模擬的黑色素瘤模型驗證了該載藥貼片的腫瘤治療效果[7]。

 

 

參考資料：

https://doi.org/10.1002/adhm.202000527

 

2. Advanced Healthcare Materials：3D打印水凝膠結(jié)構(gòu)以調(diào)控生長因子的釋放

研究材料：甲基丙烯酸縮水甘油酯改性透明質(zhì)酸（HA-GM）、巰基化肝素（Hep-SH）

目標(biāo)生長因子：血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

負(fù)載方式：肝素與生長因子間的靜電作用

檢測方法：酶聯(lián)免疫（ELISA）法，具體地，以DPBS為釋放介質(zhì)測試不同打印結(jié)構(gòu)中生長因子的釋放行為，通過ELISA定期定量檢測生長因子

研究結(jié)果：裝載生長因子的水凝膠幾何形狀可以通過3D打印來實現(xiàn)，以便在長時間內(nèi)預(yù)測生長因子的釋放動力學(xué)[3]。

 

 

參考資料：

https://doi.org/10.1002/adhm.201900977

 

3. Journal of Extracellular Vesicles：可釋放細(xì)胞外囊泡的GelMA基水凝膠用于軟骨再生

研究材料：GelMA、納米粘土(nanoclay)、小細(xì)胞外囊泡(hUC-MSCs-sEVs)

目標(biāo)外泌體：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生細(xì)胞外囊泡

負(fù)載方式：物理混合

檢測方法：BCA法蛋白定量檢測，具體地，以PBS為釋放介質(zhì)，通過BCA法定期定量檢測外泌體的釋放曲線

研究結(jié)果：GelMA/nanoclay水凝膠持續(xù)釋放sEV，具有刺激軟骨形成和治愈軟骨缺損的能力，在治療軟骨缺損方面具有廣闊的前景[5]。

 

 

參考資料：

https://doi.org/10.1080/20013078.2020.1778883

 

參考文獻：

[1] D’Souza, Susan. "A review of in vitro drug release test methods for nano-sized dosage forms." Advances in Pharmaceutics 2014 (2014).

[2] Mora, Laura, et al. "Real-time electrochemical monitoring of drug release from therapeutic nanoparticles." Journal of Controlled Release 140.1 (2009): 69-73.

[3] Wang, Pengrui, et al. "Controlled Growth Factor Release in 3D‐Printed Hydrogels." Advanced healthcare materials 9.15 (2020): 1900977.

[4] Fan, Lei, et al. "Exosomes‐Loaded Electroconductive Hydrogel Synergistically Promotes Tissue Repair after Spinal Cord Injury via Immunoregulation and Enhancement of Myelinated Axon Growth." Advanced Science (2022): 2105586.

[5] Hu, Hongxing, et al. "miR-23a-3p-abundant small extracellular vesicles released from Gelma/nanoclay hydrogel for cartilage regeneration." Journal of extracellular vesicles 9.1 (2020): 1778883.

[6] Mathieu, Mathilde, et al. "Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9." Nature communications 12.1 (2021): 1-18.

[7] Zhou, Xingwu, et al. "Biodegradable β‐Cyclodextrin Conjugated Gelatin Methacryloyl Microneedle for Delivery of Water‐Insoluble Drug." Advanced healthcare materials 9.11 (2020): 2000527.

[8] Zhao, Danyang, et al. "GelMA combined with sustained release of HUVECs derived exosomes for promoting cutaneous wound healing and facilitating skin regeneration." Journal of Molecular Histology 51.3 (2020): 251-263.