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本期介紹的是在提取實(shí)驗(yàn)樣本時(shí)各位同學(xué)反饋來的種種提問：

Q：如何從細(xì)胞中提取膠原蛋白？

A：對(duì)于膠原蛋白一般的提取方法是胃蛋白酶限制性降解法。其主要步驟是：在低溫下刮取原料細(xì)胞，在丙酮中浸泡過夜以清除脂肪，然后清洗干凈。加入少量乙酸與胃蛋白酶，酶量與濕組織量之比為1:100，再加入足量乙酸，使溶液中酶的終濃度為2 mg/mL。

攪拌過夜，但要避免過度消化。離心取上清液，通過鹽析（如使用NaCl）或透析進(jìn)一步濃縮和純化膠原蛋白。純化后可通過SDS-PAGE等方法進(jìn)一步確定提取物中膠原蛋白的濃度和純度。

酶提取法的注意事項(xiàng)：

1. 細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白可能與其他蛋白質(zhì)和多糖緊密相連，因此提取過程需要特別注意不要破壞膠原蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.  提取條件（如pH、溫度、酶的選擇）需要根據(jù)所研究的細(xì)胞類型和膠原蛋白的類型（例如I、II、III型等）進(jìn)行優(yōu)化。

此外還有酸提取法。此法主要采用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵，從而引起纖維溶解。其優(yōu)勢(shì)是可以最大程度地保留蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，但只能處理酸溶性的膠原蛋白。通常使用乙酸，如在pH2.5的條件下保持24小時(shí)。但由于種種不足，常與酶提取法聯(lián)用。

另外還有一些不常用的方法，如鹽析法、堿提取法、熱水法等。這些方法相對(duì)提取效率不如前面介紹的兩種。另外，任何實(shí)驗(yàn)都需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件和目的進(jìn)行調(diào)整，不可以本本主義。

Q：提蛋白做WB發(fā)現(xiàn)其中有雜質(zhì)，如何去除？

A：雜質(zhì)一般是上一步裂解提蛋白時(shí)留下的，所以解決思路有2點(diǎn)：提蛋白時(shí)除雜徹底，電泳前再清理一次雜質(zhì)。

提蛋白時(shí)加上超聲破碎這一步操作：超聲破碎10-15 min，然后冰??；

電泳前將樣本煮沸5 min，完全變性；離心5,000 × g ，5 min，取上清去電泳。注意如一些多次跨膜蛋白不應(yīng)水煮，這方面需要多查閱資料。

Q：Trizol法提取RNA應(yīng)該在室溫條件下還是放在冰上操作呢？

A：這個(gè)問題作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際上在不同實(shí)驗(yàn)室的protocol里有不同操作標(biāo)準(zhǔn)（或說傳統(tǒng)）。這邊建議大家圖中標(biāo)記的兩個(gè)位置的操作步驟都采用室溫就可以，沒有必要冰上孵育。第—步加入氯仿，主要是依靠震蕩來實(shí)現(xiàn)分層，只要確保離心時(shí)間和速度就可以達(dá)到效果。

Q：提取核酸的過程中，渦旋振蕩跟用力搖晃15秒不都差不多嘛，為什么書上說渦旋會(huì)導(dǎo)致DNA污染？

A：渦旋振蕩產(chǎn)生的剪切力比手用力振蕩的要?jiǎng)×液芏?，我們把離心管放在Vortex上渦旋只需要三五秒即可達(dá)到效果，手搖肯定是不行的。

因此可以說明渦旋振蕩的力度之大，所以提取時(shí)使用渦旋會(huì)造成樣本里面存在的基因組DNA斷裂碎成短片段，這樣的話就會(huì)和RNA混在一起，無法分層。

這里特指用trizol提取RNA的情形。渦旋造成的DNA斷裂主要是針對(duì)有基因組DNA存在的情況下，因?yàn)榛蚪MDNA特別長(zhǎng)容易被拉扯斷開，你可以想象一堆細(xì)繩，有的很長(zhǎng)（基因組DNA）、有的很短（各種RNA），瘋狂拉扯它們，細(xì)長(zhǎng)的基因組DNA就容易在某個(gè)地方斷開形成很多碎片。

基因組DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)本質(zhì)上是一種化學(xué)穩(wěn)定（惰性、幾乎不參與化學(xué)反應(yīng)）但物理結(jié)構(gòu)上很脆弱的東西。

此外還有兩條追加討論：

提取完是否可以渦旋：提取完之后，就只有RNA了，渦旋沒什么問題；

是否只渦旋三秒就沒事了：還是不建議，因?yàn)闆]辦法確保這三秒不出問題。

Q：提取成纖維細(xì)胞是不是不能用胰酶？因?yàn)樗陂g質(zhì)里面，還是很難提的

A：在文獻(xiàn)找到三種方法：貼塊法，只用胰酶；消化法，胰酶聯(lián)用膠原酶；商品化的分散酶。

雖然胰酶很常用，但我們認(rèn)為盲目使用效率不高，消化組織塊的能力有限。因?yàn)樵M織中是很多不同的細(xì)胞混雜在一起，如果只用胰蛋白酶進(jìn)行消化，效率不夠。

而膠原酶本身也有I II III IV四種，不同的膠原酶對(duì)應(yīng)的適應(yīng)組織不一樣，要聯(lián)合混用或配置特定比例才行。考慮到我們通常提到的胰酶、膠原酶往往是一個(gè)家族的酶的統(tǒng)稱，實(shí)際操作時(shí)需要根據(jù)其不同分型專門選擇。這里我們有一些文字材料以供參考，請(qǐng)點(diǎn)擊視頻收看。

Q：為什么要在4℃下低速離心提取植物外泌體？

A：主要是為了防止外泌體降解。

雖然外泌體其實(shí)沒有那么脆弱，但離心出體外以后，主要要防止以下幾點(diǎn)影響活性：

1.  抑制酶活性：低溫下細(xì)胞內(nèi)外的酶活性會(huì)被一定程度地抑制，尤其是蛋白酶和核酸酶，避免外泌體和內(nèi)含物被降解。

2.  穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，避免蛋白質(zhì)變性。

3.  降低代謝速率：其實(shí)也是因?yàn)榻档兔富钚?，因此?xì)胞代謝減慢，不會(huì)產(chǎn)生過多可能會(huì)干擾外泌體分離與鑒別的代謝物。