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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-27 20:40
摘 要： 通過對不同企業(yè)銀杏葉片中7種主要有效成分含量進(jìn)行差異分析，建立銀杏葉片質(zhì)量評價體系模型。按照《中華人民共和國藥典》2020年版高效液相色譜法，測定不同企業(yè)銀杏葉片中總黃酮醇苷（槲皮素、山奈酚、異鼠李素）及萜類內(nèi)酯（白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C）的含量。利用單因素方差分析、相關(guān)性分析、聚類分析和主成分分析等多元統(tǒng)計法，對不同企業(yè)多批次銀杏葉片的質(zhì)量進(jìn)行評價。不同企業(yè)30批次銀杏葉片中總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯含量均符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部規(guī)定，但不同批次之間7個有效成分含量存在差異，其中7號樣品的主成分綜合評價F值最高（5.69），在同類產(chǎn)品質(zhì)量評價最優(yōu)；槲皮素、銀杏葉內(nèi)酯B對銀杏葉片藥用品質(zhì)F值影響最大?；诙嘣y(tǒng)計法建立的銀杏葉片質(zhì)量評價體系模型，可為銀杏葉片的質(zhì)量控制和優(yōu)劣評價提供科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞： 質(zhì)量評價； 有效成分； 主成分分析； 聚類分析； 銀杏葉片； 多元統(tǒng)計法
銀杏葉片為銀杏科植物銀杏的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物制劑，主要用于治療瘀血阻絡(luò)引起的胸痹中風(fēng)、半身不遂及舌強(qiáng)語謇，目前在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病等方面具有廣泛的應(yīng)用［1-4］。研究表明銀杏葉片的主要活性成分為黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯類化合物［5-8］，除此以外還含有原花青素類、兒茶素類和有機(jī)酸類等成分。例如由德國威瑪舒培博士藥廠首次研發(fā)的銀杏葉片（金納多）中，有87%的成分是已知可控的。而《中華人民共和國藥典》關(guān)于銀杏葉片仿制藥的標(biāo)準(zhǔn)中僅關(guān)注其中“黃酮24%+內(nèi)酯6%”的黃金比例，相較于美國藥典和歐洲藥典，未設(shè)置二者的含量上限和萜類內(nèi)酯單體含量范圍［9-10］。僅通過控制少量指標(biāo)的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不具有足夠的支撐性，同時銀杏葉提取物原料中多組分和含量的差異性導(dǎo)致了銀杏葉制劑的成分含量不夠明晰，進(jìn)而拉開了國產(chǎn)銀杏葉片與進(jìn)口同種藥物之間質(zhì)量、療效和安全性的差距［11］。
在《中華人民共和國藥典》2020年版一部規(guī)定［12］的基礎(chǔ)上，筆者通過對銀杏葉片中總黃酮醇苷及萜類內(nèi)酯多成分含量進(jìn)行測定，根據(jù)多元統(tǒng)計法分析不同企業(yè)銀杏葉片中多成分含量差異，進(jìn)而建立銀杏葉片質(zhì)量評價體系模型，提高國產(chǎn)銀杏葉片的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為上市產(chǎn)品質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。
1. 實(shí)驗部分
1.1 主要儀器與試劑
分析天平：XPE205DR型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。
高效液相色譜儀：1260型，安捷倫科技（中國）有限公司。
高效液相色譜儀：U3000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
色譜柱：（1） C18型反相鍵合硅膠，250 nm×4.6 nm，5 μm，沃特世科技（中國）有限公司；（2） C18型反相鍵合硅膠，250 nm×4.6 nm，2.6 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。
甲醇、乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。
槲皮素：含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.1%，批號為100081~201610，中國食品藥品檢定研究院。
總萜類內(nèi)酯：含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為100%，批號為610017~201501，銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯的特征量值分別為28.44%、16.22%、13.73%、33.73%，中國食品藥品檢定研究院。
實(shí)驗所用玻璃器皿均用體積分?jǐn)?shù)為30%的硝酸浸泡48 h，再采用超純水反復(fù)沖洗3次，晾干后備用。
實(shí)驗用水：超純水。
銀杏葉片樣品：薄膜衣，共30批次，編號為1#～30#，具體信息見表1。
表1 銀杏葉片樣品來源
Tab. 1 Sources of Ginkgo Leaf Sample
注：1）為避免給企業(yè)造成不必要影響，生產(chǎn)企業(yè)名稱以“***”代替；2）［規(guī)格1］為每片含黃酮醇苷9.6 mg、萜類內(nèi)酯2.4 mg，［規(guī)格2］為每片含黃酮醇苷19.2 mg、萜類內(nèi)酯4.8 mg。
1.2 實(shí)驗步驟
銀杏葉片為口服藥，［規(guī)格1］為2片/次、3次/日，［規(guī)格2］為1片/次，3次/日。為了方便統(tǒng)計，設(shè)定［規(guī)格1］×2=［規(guī)格2］。銀杏葉片中總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯等多個有效成分含量的測定，按《中華人民共和國藥典》2020年版一部“銀杏葉片”項下“含量測定”方法檢驗［12］。
1.3 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)處理分析采用Excel 365、WPS office 19與Bionfomatics 微生信等數(shù)據(jù)科學(xué)分析在線平臺系統(tǒng)相結(jié)合的方法對銀杏葉片中7個有效成分測定結(jié)果進(jìn)行差異性分析［13-14］。
2. 結(jié)果與討論
2.1 含量測定結(jié)果
銀杏葉片中總黃酮醇苷、總萜類內(nèi)酯多個有效成分含量的測定結(jié)果見表2。
表2 銀杏葉片中有效成分測定結(jié)果
Tab. 2 Determination results of active ingredients in Ginkgo leaf tablets
注：總黃酮醇苷Xa=X1+X2+X3，總萜類內(nèi)酯Xb=X4+X5+X6+X7，總計Xz=Xa+Xb。
由表2可知，樣品中總黃酮醇苷、總萜類內(nèi)酯的含量均符合《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定。銀杏葉片中槲皮素、山奈酚的含量遠(yuǎn)高于其他有效成分的含量，其他成分的含量相近。
2.2 單因素方差分析
依據(jù)單因素方差分析法［15］，利用相關(guān)軟件對30批次不同企業(yè)銀杏葉片的7個有效成分測定結(jié)果，進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明不同企業(yè)銀杏葉片中槲皮素、山奈酚、異鼠李素及白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C共7種組分均具有顯著性差異，p值為0.00，小于0.05。
2.3 聚類分析
聚類分析是數(shù)據(jù)統(tǒng)計中經(jīng)常使用的一種表示方法［16-18］。聚類分析熱圖不僅能將相似樣品歸類，還能用距離反應(yīng)樣品間的相近程度；不僅能夠直觀地反映數(shù)據(jù)特征、查看數(shù)據(jù)總體情況，還能以顏色變化來顯示數(shù)據(jù)的矩陣。
以銀杏葉片中7個有效成分含量測定結(jié)果為變量，運(yùn)用相關(guān)平臺系統(tǒng)，選擇Completelinkage法為聚類方法、Squared Euclidean Distance為測量距離方法，在線繪制HeatmapCluster，Cluster是數(shù)據(jù)處理，Heatmap是數(shù)據(jù)展示。對30批銀杏葉片中有效成分含量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，X軸為不同有效成分、Y軸為樣品編號，結(jié)果見圖1。
圖1 有效成分含量聚類分析熱圖
Fig. 1 Heat map of clustering analysis of active component content
由圖1可知，編號18#、19#、23#、24#、25#、26#、28#、29#、30#為同一生產(chǎn)企業(yè)，安徽***藥業(yè)有限公司供樣；編號16#、17#為同一生產(chǎn)企業(yè)，浙江***藥業(yè)有限公司供樣。同一廠家不同批次（不同生產(chǎn)時間）的樣品聚在一組，表明該企業(yè)原料供應(yīng)可靠、工藝流程規(guī)范，藥品質(zhì)量穩(wěn)定。編號10#、12#及5#、8#為不同企業(yè)生產(chǎn)的銀杏葉片聚為一組，表明不同生產(chǎn)廠家在原料來源和生產(chǎn)工藝具有類似之處。編號7#樣品與其他類別的距離比較大，表明與其他樣品質(zhì)量存在較大的差異。
2.4 相關(guān)性分析
通過相關(guān)數(shù)據(jù)科學(xué)分析平臺，對30批次銀杏葉片中有效成分含量的測定結(jié)果進(jìn)行在線相關(guān)性分析，有效成分之間相關(guān)性分析結(jié)果見表3。由表3可知，KMO檢驗統(tǒng)計量大于0.5、Bartlett檢驗對應(yīng)p值小于0.05，各有效成分之間均有一定的相關(guān)關(guān)系，數(shù)據(jù)反映的信息存在重疊。山奈酚、槲皮素與異鼠李素，銀杏內(nèi)酯B與銀杏內(nèi)酯C呈極顯著正相關(guān)性（p值分別為0.001、0.007、0.008，均小于0.01）；銀杏內(nèi)酯A與異鼠李素呈顯著正相關(guān)性；山奈酚與銀杏內(nèi)酯A，槲皮素與銀杏內(nèi)酯C、異鼠李素相關(guān)性不顯著，白果內(nèi)酯與其他有效成分相關(guān)性均不顯著。兩有效成分之間相關(guān)系數(shù)R絕對值越大，表明兩有效成分間的聯(lián)系越緊密，主成分分析法適合對上述有效成分含量測定結(jié)果進(jìn)行降維分析［19］。
表3 有效成分之間相關(guān)性分析結(jié)果
Tab. 3 Correlation analysis result of effective components
注：1）表示在0.01水平（雙尾），極顯著相關(guān)性，p<0.01；2）表示在0.05水平（雙尾），顯著相關(guān)性，p<0.05。
2.5 主成分分析
主成分（PCA）分析是有效成分線性降維變換的多元統(tǒng)計分析方法，廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價［20-22］。該分析方法通過降維可以排除眾多化學(xué)信息中相互重疊的信息，從復(fù)雜的結(jié)果中篩選出主要影響因素，以突出主要問題，使復(fù)雜的問題簡單化。依據(jù)2.2相關(guān)性分析可知，銀杏葉片中有效成分的構(gòu)成因子較多，不同因子間存在密切相關(guān)性和相對獨(dú)立性，通過主成分分析可以將多元數(shù)據(jù)的特征在低維空間里直觀地表示出來。
運(yùn)用相關(guān)軟件，對30批銀杏葉片中7個有效成分測得數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，各主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率和累積方差貢獻(xiàn)率見表4。
表4 各主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率和累積方差貢獻(xiàn)率
Tab. 4 Eigenvalue and variance cumulative contribution of principal components
注：提取的主成分特征值應(yīng)大于1。
由表4可知，選取特征值大于1的成分作為主成分，共提取了3個有效主成分。第1主成分PCA1貢獻(xiàn)率為 30.7%，第2主成分PCA2貢獻(xiàn)率為25.0%，第3主成分PCA3貢獻(xiàn)率為20.4%。前3個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)76.0%，可以反映銀杏葉片質(zhì)量的大部分信息。
通過上述3個主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率，可以計算得到各主成分因子的荷載矩陣，結(jié)果數(shù)據(jù)見表5。
表5 主成分因子載荷矩陣
Tab. 5 Component load matrix after principal component analysis
由表5可知，第1個主成分中，山奈酚、銀杏內(nèi)酯A的載荷系數(shù)較大，其值分別為0.527、0.488，它們對第1個主成分的貢獻(xiàn)最多；第2個主成分中，白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C的載荷系數(shù)較大，其值分別為-0.466、0.503、0.567，它們對第2個主成分的貢獻(xiàn)最多；第3個主成分中，槲皮素、白果內(nèi)酯的載荷系數(shù)較大，其值分別為0.550、0.477，它們對第3個主成分的貢獻(xiàn)最多。
2.6 模型建立
用主成分載荷矩陣中各有效成分?jǐn)?shù)據(jù)，作為3個主成分中各有效成分所對應(yīng)的系數(shù)，即特征向量。根據(jù)表2、表5，不同企業(yè)生產(chǎn)的銀杏葉片3個主成分得分表達(dá)式［23-25］如下：
F1=∑PCA1，i×Xj
F2=∑PCA2，i×Xj
F3=∑ PCA3，i×Xj
即：
F1=0.399X1+0.527X2+0.394X3-0.198X4+0.488X5+0.358X6+0.046X7，
F2=-0.149X1-0.334X2-0.260X3-0.466X4+0.082X5+0.503X6+0.567X7，
F3=0.550X1+0.196X2-0.452X3+0.477X4-0.306X5+0.242X6+0.275 X7。
i為表5中不同因子， j = 1、2、3、4、5、6、7。根據(jù)上述3個主成分的方差貢獻(xiàn)率，來建立銀杏葉片品質(zhì)綜合評價模型為F = 30.6% × F1/76.0% + 25.0% × F2/76.0% + 20.4% × F3/76.0%。
根據(jù)該綜合評價模型，計算不同批次銀杏葉片的主成分得分及綜合得分F值。綜合得分F值越高，則該批銀杏葉片品質(zhì)越好，主成分得分及綜合排序見表6。由表6可知，3個批次F＞5、3個批次3＜F＜4、25個批次4＜F＜5，占83.3%，說明大多數(shù)銀杏葉片質(zhì)量接近，生產(chǎn)工藝成熟、制造路線穩(wěn)定；F值的大小與黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯含量高低不呈線性關(guān)系。
表6 主成分得分及綜合排序
Tab. 6 Principal component scores and comprehensive ranking
2.7 綜合評價
利用相關(guān)信息云平臺，在線繪制F值與有效成分相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)熱圖，結(jié)果見圖２。由圖２可知，F(xiàn)值與X1槲皮素、X6銀杏內(nèi)酯B，相關(guān)系數(shù)R值均大于0.5、顯著性p值小于0.05，F(xiàn)1與X2山奈酚相關(guān)系數(shù)大、顯著性強(qiáng)，同主成分分析結(jié)果一致。
圖２ 銀杏葉片質(zhì)量評價F值相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)熱圖
Fig. ２ Ginkgo Folium Tablet quality evaluation F value line chart
3. 結(jié)論
總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯的含量反映了銀杏葉提取物的質(zhì)量，直接影響其相關(guān)制劑的臨床療效?；谄渲?個主要活性成分的多元統(tǒng)計分析，建立了銀杏葉片的質(zhì)量體系評價模型，為藥品標(biāo)準(zhǔn)制定和質(zhì)量控制提供了統(tǒng)計學(xué)依據(jù)。
不同廠家生產(chǎn)的銀杏葉片均符合中國藥典2020年版要求，但其中總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯含量差異顯著。綜合評價結(jié)果表明，7#樣品銀杏葉片的得分F值最高，相比其他企業(yè)生產(chǎn)的同種產(chǎn)品品質(zhì)最好。銀杏葉片的質(zhì)量優(yōu)劣主要來源于生產(chǎn)過程中所使用銀杏葉提取物的質(zhì)量，不同的工藝路線也會影響最終銀杏葉提取物的質(zhì)量。從統(tǒng)計分析的角度提醒廣大以銀杏葉提取物為原料的生產(chǎn)企業(yè)，不僅要關(guān)注銀杏葉提取物本身的質(zhì)量，同時需關(guān)注銀杏葉的產(chǎn)地及當(dāng)?shù)劂y杏樹的生長環(huán)境，應(yīng)對不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地不同采收期的銀杏葉片所提取的銀杏葉提取物做質(zhì)量對比。銀杏葉的生長環(huán)境和銀杏葉提取物的生產(chǎn)過程決定了銀杏葉提取物的質(zhì)量，農(nóng)業(yè)部門和藥品生產(chǎn)監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)督指導(dǎo)，切實(shí)提高我國銀杏相關(guān)藥品的質(zhì)量。
總黃酮醇苷和總萜類內(nèi)酯反映了銀杏葉提取物主要有效成分的含量，與臨床療效直接相關(guān)［9］。基于其中7個主要活性成分的多元統(tǒng)計分析，建立了銀杏葉片的質(zhì)量體系評價模型，為藥品標(biāo)準(zhǔn)制定和質(zhì)量控制提供了統(tǒng)計學(xué)依據(jù)。銀杏葉制劑因其廣泛的藥理活性和良好的生物安全性，自上市以來便具有廣闊的應(yīng)用市場和高端的科研前景，然而我國相關(guān)制劑尚處于研究初期，我們務(wù)必盡快提高銀杏葉制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝水平，才能盡早占領(lǐng)國際主流市場，趕超國際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)。
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引用本文： 金鳳華，程慶兵，鄭正，等 . 基于多元統(tǒng)計法不同企業(yè)銀杏葉片有效成分差異性分析［J］. 化學(xué)分析計量，2024，33（12）： 70. (JIN Fenghua, CHENG Qingbing, ZHENG Zheng, et al. The difference analysis of Ginkgo Folium Tablet from different enterprises based on multivariate statistical method [J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 70.)
來源：化學(xué)分析計量
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