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1. 實(shí)驗(yàn)原理

 

Transwell實(shí)驗(yàn)是一種用于研究細(xì)胞遷移和侵襲能力的體外實(shí)驗(yàn)方法。其原理是利用帶有微孔的聚碳酸酯膜將實(shí)驗(yàn)裝置分隔成上下兩部分。上腔加入待測試細(xì)胞，下腔加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，形成化學(xué)濃度梯度。

 

細(xì)胞在趨化因子的刺激下，通過變形穿過微孔到達(dá)下腔，從而模擬體內(nèi)細(xì)胞的跨膜運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)者可以通過染色或計(jì)數(shù)遷移至下腔的細(xì)胞，評估其遷移或侵襲能力，該方法廣泛應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞趨化和藥物篩選等研究領(lǐng)域。

 

圖1 transwell細(xì)胞遷移測定圖[1]

 

2. 實(shí)驗(yàn)材料

 

耗材：Transwell小室、24孔板、培養(yǎng)皿、6孔板、棉簽

 

試劑：無血清培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、4%多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液、PBS

 

設(shè)備：離心機(jī)、倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、培養(yǎng)箱

 

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

 

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與接種

 

將對數(shù)期生長的細(xì)胞鋪于6孔板，如需要敲低某基因，則鋪板密度控制在30%-40%左右；如需讓某個(gè)基因過表達(dá)，則鋪板密度控制在60%-70%左右。

 

3.2 細(xì)胞處理

 

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行相應(yīng)處理，如可進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染以干擾特定基因表達(dá)，或者通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來過表達(dá)目的基因。

 

3.3 細(xì)胞收集與制備

 

處理結(jié)束后，消化細(xì)胞并進(jìn)行離心收集，并用無血清培養(yǎng)基重懸。

 

細(xì)胞計(jì)數(shù)，一般每個(gè)Transwell小室接種5×104個(gè)細(xì)胞，但具體接種量需結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，如目的細(xì)胞長得很慢則需要適當(dāng)多接種細(xì)胞，第一次試驗(yàn)時(shí)可在同一次實(shí)驗(yàn)中平行設(shè)計(jì)不同濃度來對比效果。

 

3.4 Transwell小室細(xì)胞接種與培養(yǎng)

 

將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞重懸，準(zhǔn)備24孔Transwell板，取100 µL懸滴加入Transwell上室，加入700 µL含20%FBS的完全培養(yǎng)基于下室，以建立穩(wěn)定的趨化誘導(dǎo)環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生遷移行為。

 

然后輕輕將Transwell裝置置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24或48h，具體培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化（若實(shí)驗(yàn)需要加入藥物刺激后看遷移結(jié)果，可給小室中加入適量藥物）。

 

 

3.5 細(xì)胞固定與染色

 

培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，并用PBS清洗，隨后，將小室轉(zhuǎn)移到干凈的24孔板中，并用4%的多聚甲醛和0.1%的結(jié)晶紫染液固定染色15 min。

 

染色后，再次用PBS清洗2遍，以去除多余染料，之后用棉簽輕輕擦除Transwell上室未遷移的細(xì)胞，確保僅保留的是已穿透膜的細(xì)胞（可通過肉眼或顯微鏡觀察上，如果沒有明顯的細(xì)胞團(tuán)塊或細(xì)胞聚集的跡象，且上室表面看起來相對干凈、均勻，沒有明顯的深色，可判斷未遷移細(xì)胞已被大部分清除）。

 

3.6 顯微鏡觀察與圖像采集

 

倒置顯微鏡拍照，將小室置于載玻片上，分別使用10X和20X物鏡，從左至右依次拍攝多個(gè)視野，保存圖片以備后續(xù)image J分析。

 

3.7 Transwell小室清洗

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，為了便于小室的重復(fù)利用，可對小室清洗和消毒：先用胰酶消化5 min，去除殘留在小室的細(xì)胞；用75%酒精進(jìn)行浸泡消毒，去除殘留物；最后，放置于紫外線燈下照射消毒，以確保小室的無菌狀態(tài)，以便下次使用。

 

圖2 transwell檢測細(xì)胞遷移的結(jié)果圖，右邊為定量分析圖[2]

 

4. 注意事項(xiàng)

 

合理控制細(xì)胞數(shù)量是取得實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，正式實(shí)驗(yàn)前可先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索適當(dāng)?shù)拿芏龋蝗豢赡軙?huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 

在取出Transwell孔板進(jìn)行觀察前，先用PBS沖洗，以去除未貼附或懸浮的細(xì)胞，洗完后應(yīng)立即固定染色，防止細(xì)胞過于干燥，染色時(shí)間也不能太長或太短。

 

小室需確認(rèn)放平于孔板中且細(xì)胞懸液要混勻，建議滴加，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中小室勿傾斜晃動(dòng)，以防止細(xì)胞鋪不均勻。

 

滴加細(xì)胞懸液的過程中要注意防止氣泡產(chǎn)生。

 

Transwell孔板的孔徑選擇：8 μm規(guī)格適配實(shí)體瘤細(xì)胞的跨膜運(yùn)動(dòng)分析，而3 μm微孔系統(tǒng)則專用于淋巴細(xì)胞亞群的定向趨化行為檢測。

 

5. 參考資料

 

[1] Justus C R, Marie M A, Sanderlin E J, Yang L V. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays [J]. Methods in molecular biology (Clifton, NJ), 2023, 2644: 349-359.

 

[2] Hu R, Cao Y, Wang Y, Zhao T, Yang K, Fan M, Guan M, Hou Y, Ying J, Ma X, Deng N, Sun X, Zhang Y, Zhang X. TMEM120B strengthens breast cancer cell stemness and accelerates chemotherapy resistance via β1-integrin/FAK-TAZ-mTOR signaling axis by binding to MYH9 [J]. Breast cancer research : BCR, 2024, 26(1): 48.