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1. 背景介紹

 

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）作為免疫分析領(lǐng)域的核心技術(shù)，憑借其高靈敏度和特異性，被廣泛應(yīng)用于科研和臨床診斷。

 

根據(jù)不同的抗體-抗原結(jié)合策略和信號放大方式，ELISA衍生出多種方法，包括：直接法、間接法、夾心法和競爭法，它們適用于不同的檢測需求。

 

下面我們將系統(tǒng)闡述四類常見ELISA的技術(shù)原理，幫助你快速區(qū)分這幾種方法之間的不同。

 

2. 實驗原理

 

ELISA實驗的核心在于酶催化底物顯色的反應(yīng)。

 

當(dāng)目標(biāo)分子被捕獲并與酶（如辣根過氧化物酶HRP）標(biāo)記的抗體結(jié)合后，加入無色底物（如TMB），HRP催化TMB與H?O?發(fā)生氧化反應(yīng)，生成藍(lán)色的可溶性產(chǎn)物（TMB二聚體），此時溶液呈現(xiàn)明顯藍(lán)色。

 

隨后加入酸性終止液，酸性條件下氧化態(tài)TMB結(jié)構(gòu)改變，藍(lán)色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，最終通過測量吸光度值實現(xiàn)目標(biāo)分子定量——顏色越深表明初始目標(biāo)濃度越高。

 

（圖片來源：https://resources.revvity.com/pdfs/app-detection-of-human-matrix-metalloproteinase-9-complex-sample-matrices.pdf）

 

3. ELISA的四種主要類型

 

1、直接法ELISA（Direct ELISA）

 

直接法ELISA的核心理念在于“簡單粗暴，一步到位”。

 

在實驗過程中，將目標(biāo)抗原固定于固相載體，直接加入酶標(biāo)記的一抗，一抗特異性結(jié)合抗原后，催化底物顯色，顯色強(qiáng)度與抗原濃度成正比。

 

直接法ELISA的優(yōu)點是操作簡單、步驟少、實驗時間短；僅需一級抗體，不需要二抗，避免了交叉反應(yīng)的可能性。

 

它的缺點是一抗需要酶標(biāo)記，成本較高；同時，因為無需二抗，所以信號放大有限，靈敏度不高，特異性有限。

 

（圖片來源：https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-a-Direct-ELISA）

 

2、間接法ELISA（Indirect ELISA）

 

間接法ELISA是在直接法的基礎(chǔ)上，通過引入二抗實現(xiàn)信號放大，其核心步驟為：抗原包被 → 一抗結(jié)合 → 酶標(biāo)二抗結(jié)合 → 顯色檢測。

 

間接法ELISA的優(yōu)點是一抗無需標(biāo)記，且一種二抗可適用于多種不同的一抗，降低了成本。

 

降低成本；同時，二抗可以放大信號，提高靈敏度，適用于檢測血清中的抗體。它的缺點是交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高，特異性一般。

（圖片來源：參考文獻(xiàn)【1】）

 

3、夾心法ELISA （Sandwich ELISA）

 

夾心法ELISA是一種非常有效且常用的免疫測定技術(shù)，以其高特異性和靈敏度著稱，適用于復(fù)雜樣品中目標(biāo)分子的定量分析。

 

雙抗夾心法就是我們所說的夾心法ELISA。“雙抗”指的是在這個過程中使用了兩種抗體：一種是捕獲抗體，另一種是檢測抗體。

 

這兩種抗體分別結(jié)合目標(biāo)抗原的不同表位，從而形成“抗體-抗原-抗體”的三明治結(jié)構(gòu)。捕獲抗體預(yù)先固定于固相載體，捕獲溶液中的目標(biāo)抗原后，檢測抗體結(jié)合抗原的另一表位，最終信號強(qiáng)度與抗原濃度正相關(guān)。

 

夾心法ELISA有兩種主要形式：直接法和間接法。在直接夾心法ELISA中，檢測抗體直接用酶標(biāo)記；而在間接夾心法ELISA中，則使用未標(biāo)記的檢測抗體，然后利用酶標(biāo)記的二抗來放大信號。

 

夾心法ELISA的優(yōu)點是特異性高、靈敏度高，適合復(fù)雜樣品中抗原的檢測。

 

但它同時也有缺點，那就是無論采用哪種形式，夾心法都要求目標(biāo)抗原至少有兩個可被抗體識別的不同表位，以保證捕獲抗體和檢測抗體都能與之結(jié)合。因此這種方法不適用于小分子抗原，因為它們可能沒有足夠的表位供兩個抗體同時結(jié)合。

（圖片來源：https://www.leinco.com/sandwich-elisa-protocol/）

 

4、競爭法ELISA（Competition ELISA）

 

競爭法ELISA是專門針對在樣本中濃度非常低的抗原或小分子抗原檢測的一種方法。

 

其核心步驟為：首先將抗體固定在微孔板表面；封閉后加入待測抗原和已知量的酶標(biāo)記抗原，兩種抗原競爭結(jié)合抗體；然后洗去未結(jié)合的抗原，加入底物顯色。

 

而在對照組中僅加入酶標(biāo)抗原（不加入待測抗原），此時酶標(biāo)抗原充分結(jié)合抗體，顯色最深。

 

因此，競爭法的檢測邏輯與其他方法相反：當(dāng)樣本中目標(biāo)抗原濃度越高，游離抗原與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合固相抗體的能力越強(qiáng)，導(dǎo)致固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原減少，最終顯色信號減弱。

 

依據(jù)這個原理，我們就可以通過顯色梯度建立“濃度-吸光度”負(fù)相關(guān)曲線，從而量化待測樣本中抗原濃度。

 

競爭法ELISA適用于適用于小分子或強(qiáng)缺乏多個表位的半抗原，抗干擾能力。它的缺點是信號強(qiáng)度與待測物濃度成反比（濃度越高，顯色越弱），因此需精確控制酶標(biāo)抗原量。

 

（圖片來源：https://www.biorender.com/template/competitive-elisa）

 

講了這么多，下面我們做了一個表格，將這幾種方法的特點進(jìn)行了對比總結(jié)：

希望這篇文章能夠幫助你理解清楚這些方法之間的差異，選擇合適的ELISA方法。

 

參考文獻(xiàn)：

 

【1】https://microbenotes.com/indirect-elisa-introduction-steps-advantages-and-protocol/