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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2025-04-14 08:43
CD3雙特異性抗體是治療癌癥的一種有前景的療法。這些分子能夠結(jié)合T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）/CD3蛋白復(fù)合物上的CD3以及腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。當(dāng)CD3和TAA同時(shí)被結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的接近會(huì)導(dǎo)致免疫突觸的形成、T細(xì)胞的激活以及細(xì)胞毒性的產(chǎn)生，造成對(duì)腫瘤細(xì)胞的定向殺傷。目前為止已經(jīng)獲批的TCE包括Catumaxomab（2009, CD3/EpCAM，已退市）、Blinatumomab（2014, CD3/CD19）、Tebentafusp（2022, CD3/gp100）、Mosunetuzumab（2022, CD3/CD20）、Teclistamab（2022, CD3/BCMA）、Epcoritamab（2023, CD3/CD20）、Glofitamab（2023, CD3/CD20）、Talquetamab（2023, CD3/GPRC5D）、Elranatamab（2023, CD3/BCMA）、Tarlatamab（2024, CD3/DLL3）、Odronextamab（2024, CD3/CD20）。典型的TCE結(jié)構(gòu)是個(gè)三聚合物，由TCE、T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞組成，通過(guò)T細(xì)胞激活，釋放炎癥因子和細(xì)胞毒性分子，殺傷腫瘤細(xì)胞。隨著CD3雙特異性抗體的火熱，從2024年下半年開始，國(guó)內(nèi)藥企研發(fā)的TCE產(chǎn)品陸續(xù)達(dá)成多個(gè)海外交易，包括嘉和生物（CD3/CD20）、同潤(rùn)生物（CD3/CD19）、岸邁生物（CD3/BCMA）、恩沐生物（CD3/CD19/CD20）、維立志博（CD3/CD19/BCMA）、康諾亞（CD3/BCMA）等。再次使得TCE雙抗成為行業(yè)研究的熱點(diǎn)之一，引起了極大的關(guān)注。尤其是TCE在實(shí)體瘤的突破，進(jìn)一步增加了這類產(chǎn)品的應(yīng)用場(chǎng)景和想象空間。
那么對(duì)于CD3雙抗TCE這類產(chǎn)品，非臨床安評(píng)方面有哪些挑戰(zhàn)呢？早在2018年的時(shí)候，F(xiàn)DA CDER與美國(guó)健康與環(huán)境科學(xué)研究所（HESI）免疫安全性技術(shù)委員會(huì)（ITC）圍繞CD3雙抗TCE產(chǎn)品的臨床前安全性評(píng)價(jià)相關(guān)主題展開過(guò)一系列討論，并以《Summary of a workshop on preclinical and translational safety assessment of CD3 bispecifics》發(fā)表，一起學(xué)習(xí)下各中觀點(diǎn)。
CD3雙抗對(duì)T細(xì)胞生物學(xué)作用的影響
來(lái)自Regeneron的Jessica Kirshner對(duì)這一主題做了分享。正常情況下，T細(xì)胞是通過(guò)TCR與主要組織相容性復(fù)合體（pMHC）遞呈的腫瘤肽段的相互作用來(lái)識(shí)別腫瘤。TCE通過(guò)同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞上的CD3和腫瘤細(xì)胞上的TAA，使T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷不再依賴內(nèi)源性TCR路徑。而且，TCR-MHC/多肽、TCE-TAA兩條路徑誘導(dǎo)的T細(xì)胞生物學(xué)作用非常相似。
這里面還有一個(gè)很有意思的話題，“通過(guò)CD3傳統(tǒng)的信號(hào)強(qiáng)度是否存在最佳情況，比如在不引發(fā)細(xì)胞因子過(guò)度釋放和/或T細(xì)胞耗竭的情況下保留抗腫瘤細(xì)胞毒性？如果存在，如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定CD3信號(hào)強(qiáng)度的“最佳點(diǎn)”？當(dāng)時(shí)，在本次會(huì)議上，沒(méi)有人表示他們已經(jīng)確定了CD3信號(hào)強(qiáng)度的“最佳點(diǎn)”，但正在使用體外T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)探索這一可能性。不過(guò)，2021年，Amgen從Teneobio花費(fèi)25億美金買了一款保持T細(xì)胞激活的同時(shí)，不會(huì)刺激細(xì)胞因子過(guò)度釋放的靶向PSMA TCE—AMG340?？上У氖牵珹MG340前列腺癌臨床Ⅰ期的27例患者ORR為0%。2023年，Amgen停止了該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)。這個(gè)想法很好，保留藥效，降低毒性，但其中機(jī)制尚未完全研究清楚。
評(píng)估CD3介導(dǎo)的T細(xì)胞生物學(xué)作用的指標(biāo)很多，包括CD3下游的信號(hào)分子（如活化T細(xì)胞的核因子、NFκB），以及T細(xì)胞激活、增殖、細(xì)胞毒性標(biāo)志物和細(xì)胞因子。還可以在體外實(shí)驗(yàn)中評(píng)估TCE與TAA或CD3的不同親和力以及TAA豐度對(duì)細(xì)胞的影響。
當(dāng)然，大多數(shù)企業(yè)表示他們主要依賴體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行項(xiàng)目決策，尤其是安全性相關(guān)的數(shù)據(jù)。除了利用天然野生型，regeneron還使用不同的人源化小鼠模型外，比如表達(dá)人類CD3信號(hào)復(fù)合體小鼠，以及將人類TAA敲入小鼠基因座，并用于支持藥理學(xué)和安全性相關(guān)的研究。
腫瘤抗原表達(dá)及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)
與靶點(diǎn)相關(guān)的在靶（on-target）毒性可以分為兩類：一類是“on target/on-tumor”毒性，主要包括細(xì)胞因子釋放及其相關(guān)毒性，嚴(yán)重程度取決于腫瘤負(fù)荷以及TCE到達(dá)腫瘤部位的能力。還有一類是“on target/off-tumor”毒性，與TAA在正常組織中的表達(dá)水平和分布直接相關(guān)。
由于非臨床安全性測(cè)試通常不使用腫瘤疾病模型，因此“on target/on-tumor”相關(guān)的細(xì)胞因子釋放通常不在非臨床階段進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估，換句話說(shuō)，采用健康猴或者其他種屬也實(shí)現(xiàn)不了這一毒性的評(píng)估。取而代之的是在體外腫瘤細(xì)胞/免疫細(xì)胞共孵育體系中考察細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。另外，TAA驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子釋放在臨床是可監(jiān)測(cè)且可管理的。
與“on target/on-tumor”不同，“on target/off-tumor”毒性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是臨床前研究的重點(diǎn)所在，比如正常組織中靶點(diǎn)分布、細(xì)胞定位和表達(dá)水平等。需要在藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬中開展標(biāo)準(zhǔn)毒理學(xué)研究，特別關(guān)注靶點(diǎn)表達(dá)相關(guān)的組織。
安進(jìn)公司的Hervé Lebrec博士分享了如何評(píng)估正常組織中TAA表達(dá)和潛在風(fēng)險(xiǎn)。首先通過(guò)靶點(diǎn)表達(dá)的文獻(xiàn)進(jìn)行全面回顧和總結(jié)，初步了解靶點(diǎn)的表達(dá)和分布情況。然而，文獻(xiàn)提供的靶點(diǎn)表達(dá)信息往往無(wú)法滿足需求，這就需要借助一些試驗(yàn)手段和工具，比如用于mRNA分析的RNA測(cè)序、原位雜交和定量PCR，以及用于蛋白分析的western blot、免疫組化和質(zhì)譜分析。而且，通常需要多種方法交叉確認(rèn)，以全面、客觀了解靶點(diǎn)在不同組織中的表達(dá)和分布情況。
同樣來(lái)自安進(jìn)公司的Oliver Thomas對(duì)早期靶點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在預(yù)測(cè)BiTE抗體（安進(jìn)的雙抗平臺(tái)）非臨床安全性特征中的作用進(jìn)行了回顧性分析。猴通常是TCE非臨床毒理研究中唯一相關(guān)種屬。如果在猴的正常組織中存在目標(biāo)TAA表達(dá)，通常在給藥后48小時(shí)內(nèi)會(huì)觀察到一些反應(yīng)，包括嘔吐、活動(dòng)減少、食欲不振、腹瀉、短暫體溫升高、急性期反應(yīng)（CRP增加、球蛋白和纖維蛋白原增加、白蛋白減少）、血液學(xué)變化（淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、T細(xì)胞激活）、其他白細(xì)胞亞群的變化以及短暫的細(xì)胞因子釋放（如IFN-γ、IL-6、MCP-1和TNF-α）。經(jīng)歷較短的暴露間隔后（約1-4周，取決于分子的活性），可以觀察到更完整、全面的靶器官毒性表現(xiàn)。急性細(xì)胞因子釋放的強(qiáng)度與靶點(diǎn)在正常組織中的表達(dá)水平及其特定位置有關(guān)。如果靶點(diǎn)在正常組織中完全不表達(dá)，則不會(huì)發(fā)生細(xì)胞因子釋放；如果TAA比較容易被CD3雙抗識(shí)別（如表達(dá)在血細(xì)胞上時(shí)），則細(xì)胞因子反應(yīng)通常更強(qiáng)。CD3雙抗觀察到的組織病理學(xué)變化多數(shù)情況下與靶點(diǎn)表達(dá)相關(guān)，包括輕微到嚴(yán)重的混合細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥和/或單細(xì)胞壞死?？梢詫Ⅲw內(nèi)毒理研究結(jié)果與靶點(diǎn)表達(dá)和分布特點(diǎn)相結(jié)合，進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)-收益評(píng)估，并考慮潛在的毒性可監(jiān)測(cè)性和可管理性。
Xencor公司的Liz Bogaert博士認(rèn)為，僅依賴公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)序列和表達(dá)數(shù)據(jù)可能會(huì)低估猴中毒理反應(yīng)。以葉酸受體1（FOLR1）這個(gè)靶點(diǎn)為例，其在多種正常組織中表達(dá)，包括正常肺和腎。猴中的毒性包括細(xì)胞因子釋放，以及肺和腎損傷等，但觀察到的劑量遠(yuǎn)低于預(yù)期。原因是體外活性試驗(yàn)采用的重組猴FOLR1蛋白序列引用自公開發(fā)表的文獻(xiàn)中的序列，而該序列與猴子中的實(shí)際FOLR1序列并不一致。直接導(dǎo)致了CD3雙抗在猴子中的活性和毒性被嚴(yán)重低估。不過(guò)，個(gè)人認(rèn)為這種情況發(fā)生的概率比較小。
分子結(jié)構(gòu)、CD3和/或TAA親和力對(duì)活性、安全性和有效性的影響
輝瑞公司的Adam Root介紹了各種CD3雙抗format，并認(rèn)為企業(yè)在設(shè)計(jì)CD3 TCE結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)考慮多種因素。有些考慮是從實(shí)際操作的角度出發(fā)，如知識(shí)產(chǎn)權(quán)或生產(chǎn)可行性，另一些考慮則來(lái)自科學(xué)驅(qū)動(dòng)，如T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的空間距離、對(duì)CD3和/或腫瘤抗原的結(jié)合價(jià)數(shù)（單價(jià)、雙價(jià)或其他）、給藥方案、特定的PK特性以及預(yù)期的安全性特征。例如，半衰期較短的CD3雙抗在管理新出現(xiàn)的安全性問(wèn)題方面具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢钥焖俦磺宄?，但在給藥方案方面存在劣勢(shì)，需連續(xù)或頻繁給藥。Blinatumomab就是一款結(jié)構(gòu)中沒(méi)有Fc的短半衰期TCE，臨床需要長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)靜脈輸注給藥。除了結(jié)構(gòu)外，TCE與CD3的親和力被認(rèn)為是決定療效和安全性的一個(gè)關(guān)鍵因素。CD3親和力過(guò)高可能會(huì)降低系統(tǒng)暴露量，并將CD3雙抗從腫瘤轉(zhuǎn)移到含有T細(xì)胞的組織。親和力過(guò)低則可能會(huì)降低T細(xì)胞的激活能力，影響藥效。
有人提出CD3結(jié)合的動(dòng)力學(xué)可能會(huì)影響細(xì)胞因子釋放。也有人認(rèn)為CD3結(jié)合表位不同，所引發(fā)的T細(xì)胞作用也有差異。大多數(shù)CD3雙抗靶向CD3ε的N端線性肽，尚不清楚靶向不同的CD3表位是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子釋放的比率不同。不過(guò)，前文已經(jīng)提到，Teneobio開發(fā)出了具備CD3結(jié)合表位差異化的TCE，維持T細(xì)胞毒性的同時(shí)，細(xì)胞因子釋放并不明顯，但臨床研究的失利為這一思路蒙上了陰影。
關(guān)于TAA結(jié)合效價(jià)問(wèn)題，與會(huì)人員普遍認(rèn)為，根據(jù)結(jié)合親和力和結(jié)構(gòu)，增加結(jié)合效價(jià)可能有利于對(duì)腫瘤的靶向和重定向，但這些潛在益處會(huì)增加CMC研究的復(fù)雜性。放至今日，CMC問(wèn)題應(yīng)該相對(duì)容易解決。
羅氏公司的Anna Maria Giusti博士分享了一個(gè)很有意思的案例，兩個(gè)分子具有相同腫瘤靶點(diǎn)——FOLR1，相同構(gòu)造（TAA:CD3=2:1），且兩種分子對(duì)FOLR1的親和力都高于CD3。不同的是，第一個(gè)分子對(duì)FOLR1的結(jié)合親和力（affinity）比第二個(gè)分子高20倍以上，但由于采用了雙價(jià)TAA結(jié)合，兩種分子對(duì)腫瘤的結(jié)合親合力（avidity）相似。動(dòng)物毒理研究結(jié)果顯示，食蟹猴給予低劑量的第一個(gè)分子（higher affinity）時(shí)，沒(méi)有觀察到臨床癥狀，但10 mg/kg劑量的食蟹猴出現(xiàn)了不良反應(yīng)，包括呼吸異常，導(dǎo)致在給藥后24小時(shí)實(shí)施安樂(lè)死，并在肺部觀察到病變（水腫、充血和急性炎癥）。免疫組化顯示，食蟹猴和人肺泡細(xì)胞上表達(dá)FOLR1。由于擔(dān)心人體可能會(huì)出現(xiàn)類似的肺部病理變化，因此開發(fā)了第二種分子，立項(xiàng)依據(jù)是腫瘤細(xì)胞相對(duì)于正常組織表達(dá)更高水平FOLR1，第二種分子能保留與腫瘤的類似親合力（avidity）同時(shí)，降低對(duì)正常組織如肺部的影響。
出乎意料的是，當(dāng)在食蟹猴中測(cè)試這種對(duì)FOLR1親和力低得多的第二種分子時(shí)，觀察到了與第一種分子完全不同的癥狀：眼睛“渾濁”與單核細(xì)胞在睫狀體和虹膜浸潤(rùn)，前房和后房有滲出物。因此，雖然避免了第一種分子出現(xiàn)的肺部毒性，但觀察到了一種新的毒性表現(xiàn)。通過(guò)IHC方法未能在眼睛中找到FOLR1，但通過(guò)定量PCR鑒定出了FOLR1 mRNA。因此，兩種對(duì)靶標(biāo)具有不同親和力的FOLR1 CD3雙抗顯示出不同的靶點(diǎn)相關(guān)的毒性特征。由于兩種毒性特征均不可接受，因此該項(xiàng)目被終止。這種“on-target/off-tumor”毒性是TCE最不愿看到，也最難避免的毒性，是這類分子開發(fā)失敗的主要風(fēng)險(xiǎn)之一。
基因泰克公司的Karen Staflin博士以一個(gè)針對(duì)HER2的CD3雙抗為例，展示了對(duì)CD3和/或TAA的結(jié)合親和力對(duì)非臨床療效和耐受性的影響。由于HER2在正常組織中廣泛表達(dá)，因此存在對(duì)on-target/off-tumor毒性以及細(xì)胞因子釋放的擔(dān)憂。構(gòu)建了基于全長(zhǎng)IgG1抗體的HER2/CD3雙抗（1:1形式），并具備低Fc效應(yīng)功能特點(diǎn)。篩選出與CD3靶點(diǎn)親和力差異為30倍，HER2為7倍的不同變體進(jìn)行組合。最初，將低親和力抗HER2變體與低親和力或高親和力抗CD3配對(duì)。兩種分子在體外對(duì)HER2陽(yáng)性靶細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，并在人HER2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中觀察到體內(nèi)抗腫瘤藥效。然而，它們的耐受性特征不同。低親和力CD3變體在小鼠和食蟹猴中耐受性良好，但高親和力CD3變體在小鼠中出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放增加和體重減輕，以及食蟹猴出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)。接下來(lái)，將低親和力抗CD3變體與低親和力或高親和力抗HER2配對(duì)。在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，使用表達(dá)食蟹猴HER2的靶細(xì)胞時(shí)，高親和力抗HER2的分子活性表現(xiàn)更好。兩種分子在食蟹猴體內(nèi)均產(chǎn)生了藥理學(xué)反應(yīng)，如淋巴細(xì)胞短暫減少。然而，高親和力抗HER2變體耐受性不如低親和力分子。研究人員通過(guò)采用劑量分割方案（第0天給半劑量，第1天給半劑量，第8天給全劑量）減輕了食蟹猴中觀察到的高親和力抗HER2變體的細(xì)胞因子釋放。劑量分割導(dǎo)致在給藥初期雙抗的Cmax降低，同時(shí)又維持了總暴露量的不變。在腫瘤異種移植模型中，劑量分割顯示對(duì)藥效沒(méi)有影響。Karen Staflin博士這個(gè)思路其實(shí)被用于很多已上市或在研TCE的設(shè)計(jì)，即高親和力TAA與低親和力CD3的分子進(jìn)行配對(duì)，臨床則采用step-up dose策略給藥，降低首次給藥Cmax，增加患者耐受性。
來(lái)自MacroGenics的Ezio Bonvini博士，也提到了關(guān)于將細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子釋放花開兩朵，各表一枝的類似說(shuō)法，即各論各的。他列舉了一系列CD123/CD3 DART結(jié)構(gòu)的分子，這些分子與CD3結(jié)合表位存在差異。研究比較了CD3的親和力、結(jié)合和解離速率與細(xì)胞毒性EC50的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，一種低親和力的CD3變體在更高濃度下表現(xiàn)出與野生型分子相似的細(xì)胞毒性水平，但在細(xì)胞毒性相當(dāng)?shù)那闆r下，細(xì)胞因子釋放顯著減少。此外，低親和力變體需要更高濃度才能在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，以及在小鼠體內(nèi)模型中需要更高劑量才能實(shí)現(xiàn)與野生型分子相似的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果，但在所有劑量水平下，包括達(dá)到最大抗腫瘤效果的劑量，細(xì)胞因子釋放均減少。在食蟹猴中，低親和力CD3變體在高達(dá)20 mg/kg的劑量下表現(xiàn)出良好的耐受性，并且暴露量更高、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，而高親和力CD3變體在3 mg/kg劑量下就表現(xiàn)出細(xì)胞因子釋放和較差的耐受性。此外，一種針對(duì)B細(xì)胞的低親和力CD3變體（與CD123靶向變體共享相同的CD3結(jié)合臂）在食蟹猴中能夠有效耗竭B細(xì)胞，并表現(xiàn)出良好的耐受性，進(jìn)一步確認(rèn)了靶向CD123變體的觀察結(jié)果。MacroGenics的CD123/CD3 TCE（MGD024）目前處于臨床Ⅰ期研究階段，并于2022年10與Gilead達(dá)成合作，共同開發(fā)?？赡苡信笥褧?huì)問(wèn)，采用同樣思路的Teneobio不是已經(jīng)失敗了嗎，可別忘了，Teneobio開發(fā)的是實(shí)體瘤靶點(diǎn)，MacroGenics這個(gè)是血液瘤，TCE在血液瘤里面已經(jīng)上市了很多產(chǎn)品，實(shí)體瘤卻僅上市了2款產(chǎn)品，失敗了不下幾十個(gè)，實(shí)體瘤本身就是TCE失敗的重災(zāi)區(qū)。一切還是以臨床數(shù)據(jù)說(shuō)話，期待MacroGenics通過(guò)CD3表位差異的設(shè)計(jì)能否在臨床完成低毒、高效的概念驗(yàn)證。
CytomX的Jennifer Richardson博士分享了TCE中的Probody思路，這是一種抗體前藥設(shè)計(jì)，使TCE在腫瘤微環(huán)境中選擇性激活。簡(jiǎn)單講，就是TCE的抗原結(jié)合區(qū)域采用遮蔽肽封閉，同時(shí)用可被蛋白酶降解的連接子偶聯(lián)。這類蛋白酶在腫瘤中特異性高表達(dá)。與未遮蔽的對(duì)照分子相比，CytomX的Probody TCE在體外對(duì)正常細(xì)胞的抗原結(jié)合和活性降低，同時(shí)在某些小鼠異種移植瘤模型中藥效也降低。通過(guò)使用更易被蛋白酶切割的底物，克服了小鼠中療效降低的問(wèn)題。使用較弱的CD3結(jié)合臂和更緊密的遮蔽肽提高了食蟹猴的耐受性。遮蔽肽技術(shù)有可能擴(kuò)大CD3雙抗的治療窗口。不過(guò)，與會(huì)者指出，遮蔽肽技術(shù)能否提高治療指數(shù)將取決于其在腫瘤微環(huán)境中選擇性釋放遮蔽肽的能力。需要注意的是，這是發(fā)生在2018年的討論會(huì)。那么從2025年，回頭看，CytomX與Amgen合作的CX-904（CD3/EGFR）、與BMS合作的CTLA-4免疫檢查點(diǎn)前藥BMS-986288相繼停止開發(fā)。再次提示，前藥設(shè)計(jì)不僅遮蔽那么簡(jiǎn)單，有效釋放才是關(guān)鍵。
體內(nèi)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究
本部分主要圍繞三個(gè)主題進(jìn)行討論：1）基因工程小鼠在安全性評(píng)價(jià)中的作用；2）食蟹猴非臨床安全性評(píng)價(jià)的考量；3）無(wú)毒理學(xué)研究相關(guān)動(dòng)物種屬的考量。
基因工程小鼠在安全性評(píng)價(jià)中的作用
來(lái)自Dartmouth College的Charles Sentman博士展示了CD3雙抗在不同小鼠模型中的療效數(shù)據(jù)，包括在免疫缺陷的NSG小鼠中的胰腺癌模型，以及在免疫正常C57BL/6小鼠中的淋巴瘤（RMA）、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤（B16）數(shù)據(jù)等。發(fā)現(xiàn)，耗竭CD4+或CD8+ T細(xì)胞亞群會(huì)影響CD3雙抗藥效。通過(guò)基因敲除模型發(fā)現(xiàn)，穿孔素和IFNγ是抗腫瘤作用發(fā)揮的關(guān)鍵成分，但它們也與毒性的產(chǎn)生相關(guān)。經(jīng)過(guò)治療后腫瘤完全消退的小鼠，再次接種相同腫瘤后，抗腫瘤作用依然存在，證明CD3雙抗存在免疫記憶。這些可能與TCE在開發(fā)階段的安評(píng)相關(guān)性較小，更多提示我們可以基于基因工程改造的小鼠研究TCE藥理學(xué)和毒理學(xué)相關(guān)目的的研究。
Regeneron的 Jessica Kirshner博士重點(diǎn)介紹了通過(guò)Velocigene技術(shù)基因工程改造的小鼠，這些小鼠CD3的位置表達(dá)人類CD3（胞外區(qū)），并在小鼠細(xì)胞上表達(dá)人TAA，即人類CD3和TAA基因的雙敲入。另外，小鼠腫瘤細(xì)胞也同樣導(dǎo)入了人TAA。為了確保模型能夠達(dá)到預(yù)期的T細(xì)胞水平以及通過(guò)抗人CD3抗體對(duì)T細(xì)胞的充分激活，對(duì)轉(zhuǎn)基因模型進(jìn)行了表征。此外，還評(píng)估了小鼠組織中人TAA的表達(dá)，以確保人TAA表達(dá)的一致性。
Kirshner博士分享了REGN1979（CD3/CD20雙抗）和REGN4018（CD3/MUC16雙抗）兩個(gè)案例。Regeneron的CD3雙抗是全長(zhǎng)抗體，F(xiàn)c通過(guò)改造去除了效應(yīng)功能。在REGN1979的案例中，人源化小鼠模型中快速出現(xiàn)了外周血B細(xì)胞耗竭和短暫的細(xì)胞因子釋放，并抑制了腫瘤生長(zhǎng)。同樣，REGN1979給予食蟹猴后，發(fā)現(xiàn)了類似的B細(xì)胞耗竭和細(xì)胞因子釋放。此外，對(duì)淋巴組織（如脾臟和腸系膜淋巴結(jié)）的免疫組化分析顯示有深度的B細(xì)胞耗竭。在REGN4018的案例中，也使用了CD3和MUC16基因人源化的小鼠模型。小鼠的MUC16在多種具有間皮/漿膜表面的組織中表達(dá)（如卵巢、氣管）。REGN4018在小鼠中誘導(dǎo)了抗腫瘤活性，但沒(méi)有導(dǎo)致全身性細(xì)胞因子釋放或on target/off tumor組織的病理變化。在食蟹猴中，觀察到稍微不同的反應(yīng)，如CRP和IL-6短暫增加。
總之，基因工程小鼠可以作為初步評(píng)估TCE分子藥效和安全性的模型之一。
食蟹猴非臨床安全性評(píng)價(jià)的考量
Janssen 的Shoba Shetty博士分享了一個(gè)案例，展示了通過(guò)調(diào)整CD3雙抗的劑量來(lái)減輕食蟹猴中的細(xì)胞因子釋放。該分子是一種針對(duì)實(shí)體瘤靶點(diǎn)的抗體類CD3雙抗，F(xiàn)c去除了效應(yīng)功能。TAA在多種腫瘤類型以及某些正常組織中表達(dá)。
在初步的探索性研究中，食蟹猴每周一次或兩次的給藥方案導(dǎo)致了急性細(xì)胞因子釋放相關(guān)的劑量限制性毒性，甚至出現(xiàn)了動(dòng)物死亡。臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、弓背和活動(dòng)減少，主要出現(xiàn)在首次給藥后。觀察到細(xì)胞因子呈劑量依賴性增加，高濃度細(xì)胞因子與死亡相關(guān)，但隨著重復(fù)給藥，細(xì)胞因子水平有所下降。臨床病理學(xué)變化包括白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的短暫減少以及急性期反應(yīng)。有趣的是，早期死亡的動(dòng)物組織中未見(jiàn)鏡檢，而存活動(dòng)物則表現(xiàn)出多組織的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及表達(dá)TAA器官的輕微組織退化/再生。
后續(xù)研究探索了通過(guò)低劑量預(yù)處理免疫系統(tǒng)，然后再給予較高劑量，以嘗試減輕細(xì)胞因子介導(dǎo)的毒性。選擇了一個(gè)初始的低劑量，預(yù)計(jì)動(dòng)物可以耐受，但會(huì)產(chǎn)生藥效學(xué)效應(yīng)（如短暫的淋巴細(xì)胞減少和最小程度的細(xì)胞因子釋放）。評(píng)估了兩種動(dòng)物體內(nèi)劑量遞增方案，測(cè)試的最高劑量達(dá)到了初始最大耐受劑量的10-25倍。所有動(dòng)物均存活，臨床癥狀改善，并且細(xì)胞因子（例如IL-6和TNF-α）顯著抑制。
通過(guò)step-up給藥方案，可以潛在解決TCE這類產(chǎn)品在食蟹猴毒理學(xué)研究中可能碰到的暴露量不夠的問(wèn)題。
Genentech的Amy Sharma分享了一個(gè)CD3/CLL-1雙抗的案例研究，本品擬用于治療急性髓系白血?。ˋML）。Genentech評(píng)估了兩種CD3雙抗，它們與CD3的親和力相差100倍，與CLL-1的親和力相同。此外，兩株抗體與食蟹猴靶點(diǎn)的親和力均與人體相似。
研究首先在CD3和CLL-1雙靶點(diǎn)人源化小鼠中開展，在0.5 mg/kg的劑量下，兩個(gè)分子均能實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞的耗竭。不過(guò)，同樣劑量在食蟹猴中不能耐受，采用的“哨兵”動(dòng)物先行給藥的方案。后續(xù)進(jìn)行了劑量調(diào)整。發(fā)現(xiàn)低親和力分子在較低劑量下，食蟹猴耐受性良好，并在第8天觀察到髓系細(xì)胞最大程度的耗竭。另外，低親和力和高親和力分子的暴露量相似，所有動(dòng)物均產(chǎn)生了抗藥物抗體（ADA）。低親和力分子誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放低于高親和力分子，但兩者在單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的耗竭程度和持續(xù)時(shí)間上相似。兩種分子均表現(xiàn)出雙相反應(yīng)，急性細(xì)胞因子介導(dǎo)的效應(yīng)在給藥后24-48小時(shí)出現(xiàn)，而亞急性的on target/off tumor效應(yīng)（如發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少或可能由骨髓抑制引起的繼發(fā)性感染）在給藥后數(shù)天出現(xiàn)。
這個(gè)案例給出了3條TCE毒理研究的經(jīng)驗(yàn)：1）可以設(shè)置哨兵動(dòng)物，先行給藥，并對(duì)哨兵動(dòng)物設(shè)置7天的觀察期，以考察延遲毒性；2）基于人源化小鼠藥理學(xué)研究設(shè)置食蟹猴試驗(yàn)的劑量時(shí)需謹(jǐn)慎，尤其是小鼠和猴的靶點(diǎn)表達(dá)譜可能不一致，且小鼠對(duì)炎癥刺激的耐受更強(qiáng)；3）由于ADA的產(chǎn)生，研究持續(xù)時(shí)間受到限制，畢竟ADA的發(fā)生率很高。
輝瑞公司的Cris Kamperschroer博士分享了一個(gè)通過(guò)藥理學(xué)手段影響食蟹猴中細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞活性的案例。采用一種CD3/TAA雙抗，含有去除效應(yīng)功能的Fc，該TAA在上皮細(xì)胞和漿膜細(xì)胞中表達(dá)。為減輕細(xì)胞因子的影響，研究采取了三種方法：1）抗IL-6單抗；2）Janus激酶抑制劑（JAKi）；3）糖皮質(zhì)激素藥物地塞米松（DEX）。均在CD3雙抗給藥前開始使用。研究終點(diǎn)包括血清細(xì)胞因子水平、與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的臨床癥狀（如嘔吐、活動(dòng)減少和弓背）以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的急性期蛋白CRP。還評(píng)估了T細(xì)胞激活相關(guān)標(biāo)志物如外周和脾臟CD8+ T細(xì)胞上的CD69表達(dá)以及可溶性CD25水平，以及對(duì)TAA陽(yáng)性細(xì)胞的預(yù)期殺傷作用。結(jié)果顯示，JAKi或DEX降低了某些細(xì)胞因子（如IL-6和IFN-γ）的水平，并減輕了與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的臨床癥狀，而抗IL-6單抗則沒(méi)有這種效果。盡管看到了抗IL-6單抗的藥理學(xué)相關(guān)PD指標(biāo)變化（表現(xiàn)為沒(méi)有誘導(dǎo)CRP升高，因?yàn)镮L-6誘導(dǎo)CRP），但其對(duì)細(xì)胞因子釋放的影響較弱，這與臨床上采用抗IL-6受體（IL-6R）抗體（如托珠單抗）治療細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的效果相反。
在T細(xì)胞激活方面，只有JAKi抑制了T細(xì)胞上可溶性CD25和CD69的上調(diào)。組織病理學(xué)評(píng)分顯示，所有細(xì)胞因子阻斷劑均未避免TAA表達(dá)細(xì)胞的損傷的出現(xiàn)?？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，JAKi和DEX在抑制細(xì)胞因子釋放和防止細(xì)胞因子相關(guān)臨床癥狀方面是有效的，而抗IL-6單抗則無(wú)效。所有細(xì)胞因子阻斷劑未影響T細(xì)胞對(duì)組織中表達(dá)TAA細(xì)胞的活性，但JAKi抑制了T細(xì)胞激活標(biāo)志物的上調(diào)。
正是由于JAKi也影響了T細(xì)胞激活，因此DEX被認(rèn)為是預(yù)防CRS的最佳選擇，既降低細(xì)胞因子相關(guān)毒性，又不影響T細(xì)胞激活和殺傷。當(dāng)然，本研究的目的是評(píng)估在臨床上治療或預(yù)防CRS的潛在選擇。由于毒理研究的目的是表征分子的潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)，這其中就包括與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，因此不推薦在非臨床毒理研究中進(jìn)行藥理學(xué)手段的干預(yù)，這本身就會(huì)引入新的變量，使整項(xiàng)研究更為復(fù)雜。還是建議采用Janssen 的Shoba Shetty博士推薦的動(dòng)物體內(nèi)劑量遞增方案。
來(lái)自Janssen的Chidozie (Dozie) Amuzie博士討論了接受CD3雙抗治療的食蟹猴中觀察到的組織病理學(xué)變化。伴隨CRS癥狀的食蟹猴，鏡下發(fā)現(xiàn)包括多器官的單核細(xì)胞浸潤(rùn)和血管炎癥。其中，血管炎癥不應(yīng)與血管和血管周圍免疫細(xì)胞浸潤(rùn)混淆。TCE免疫細(xì)胞浸潤(rùn)位于小至中等大小動(dòng)脈的周圍和壁內(nèi)。這與由單克隆抗體或反義寡核苷酸誘導(dǎo)的血管炎癥所觀察到的血管壁增厚或破壞明顯不同。
Amuzie還分享了一些與CD3雙抗相關(guān)的特定組織中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)案例。例如，一些非CD19靶向的CD3雙抗，觀察到腦部單核細(xì)胞浸潤(rùn)（MNCI）。雖然在對(duì)照動(dòng)物中也可以觀察到MNCI，但通常位于蛛網(wǎng)膜下腔和腦膜的軟腦膜之間，而CD3雙抗對(duì)應(yīng)的MNCI深入腦實(shí)質(zhì)和神經(jīng)纖維中，且浸潤(rùn)更為密集。通過(guò)原位雜交技術(shù)鑒定，腦部的MNCI主要由T細(xì)胞組成。不過(guò)，這些動(dòng)物并未表現(xiàn)出任何神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的癥狀。
腎上腺是另一個(gè)需要關(guān)注的器官，尤其是出現(xiàn)嚴(yán)重急性反應(yīng)的動(dòng)物，皮質(zhì)中觀察到有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并與細(xì)胞因子釋放相關(guān)。當(dāng)使用不同的給藥方案（如增加給藥頻率）時(shí)，腎上腺髓質(zhì)中可以看到密集的MNCI。其他在較高不耐受劑量下觀察到鏡檢變化的器官主要是腎臟和肺。腎小管變性/再生最早可在初次給藥后24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到。當(dāng)然，腎臟毒性的最終定性還要結(jié)合BUN或肌酐等其它指標(biāo)綜合判定。
無(wú)毒理學(xué)研究相關(guān)動(dòng)物種屬的考量
Immatics公司的Frank Schwöbel博士回顧了該公司CD3雙抗的非臨床研究策略。這種雙抗由抗CD3 scFv（單鏈抗體片段）和識(shí)別腫瘤抗原肽/白細(xì)胞抗原（HLA）復(fù)合物的單鏈TCR（scTv）組成。Immatics的XPRESIDENT平臺(tái)擁有一個(gè)龐大的肽-HLA信息數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠揭示40多個(gè)不同器官腫瘤與正常組織之間所遞呈的肽段差異。由于HLA具有高度的種屬特異性，傳統(tǒng)的體內(nèi)動(dòng)物研究并不適用于臨床前安全性評(píng)估。Immatics曾考慮使用HLA-A*02轉(zhuǎn)基因小鼠，但發(fā)現(xiàn)這些小鼠有以下不足：1）抗原處理的差異；2）人與動(dòng)物蛋白序列的差異；3）人與動(dòng)物基因表達(dá)譜的差異。因此，臨床前安全性評(píng)估主要基于計(jì)算機(jī)模擬（in silico）和體外（in vitro）測(cè)試。比如，會(huì)評(píng)估雙抗對(duì)正常組織上表達(dá)的相似序列肽段的潛在交叉反應(yīng)性，以及與TCR結(jié)合相似肽段的交叉反應(yīng)性。此外，還會(huì)針對(duì)靶點(diǎn)陰性的腫瘤細(xì)胞和原代健康組織細(xì)胞panels進(jìn)行功能測(cè)試。這些數(shù)據(jù)與針對(duì)靶點(diǎn)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的體外藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，以計(jì)算治療窗口。
Immunocore的Joseph Dukes博士分享了該公司開發(fā)的CD3 TCE，也是由抗CD3 scFv和識(shí)別MHC/抗原肽（pMHC）的TCR組成。CD3結(jié)合域具有納摩爾級(jí)別的親和力，而pMHC結(jié)合域經(jīng)過(guò)親和力成熟，達(dá)到皮摩爾級(jí)別的親和力，旨在能夠識(shí)別細(xì)胞表面極低數(shù)量（10-100個(gè)）的表位。
由于CD3和pMHC結(jié)合域均只針對(duì)人，沒(méi)有合適的毒理相關(guān)種屬。Immunocore曾考慮使用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，但情況與Immatics遇到的類似，由于肽段中常見(jiàn)的跨種屬點(diǎn)突變（通常會(huì)破壞TCR結(jié)合），以及數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)基因小鼠中超過(guò)60%的HLA呈遞肽段缺失，使得在該模型中評(píng)估pMHC結(jié)合域的特異性沒(méi)有價(jià)值。因此，Immunocore開發(fā)了一套基于人類的in silico和in vitro的測(cè)試方案，用于預(yù)測(cè)臨床安全性和特異性。In silico方案利用內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)中的pMHC肽段，評(píng)估特定TCR與其他pMHC的潛在交叉反應(yīng)性。體外安全測(cè)試方案包括對(duì)約100種細(xì)胞系（覆蓋約20個(gè)器官的50-60種組織類型）進(jìn)行了測(cè)試，如評(píng)估異體反應(yīng)性、血小板激活、全血中的細(xì)胞因子釋放以及正常人類組織中目標(biāo)肽段和蛋白的表達(dá)。
大部分安全性測(cè)試涉及使用原代細(xì)胞、人T細(xì)胞和TCE分子進(jìn)行共培養(yǎng)，并建立合適的檢測(cè)指標(biāo)，如T細(xì)胞激活、IFN-γ或顆粒酶B的產(chǎn)生，或靶細(xì)胞殺傷。這些體外實(shí)驗(yàn)還用于基于MABEL法確定首次人體（FIH）劑量。
首個(gè)進(jìn)入臨床開發(fā)的分子是IMCgp100，其靶向由HLA-A*0201呈遞的gp100280-288肽段，該肽段在正常皮膚和眼睛的黑色素細(xì)胞以及黑色素瘤（尤其是葡萄膜黑色素瘤）中表達(dá)。體外數(shù)據(jù)顯示，在1納摩爾濃度下藥物無(wú)脫靶效應(yīng)，最大藥理效應(yīng)出現(xiàn)在100皮摩爾濃度，MABEL被確定為1皮摩爾。針對(duì)正常黑色素細(xì)胞的活性預(yù)計(jì)在皮摩爾范圍內(nèi)，基于本品的作用機(jī)制，預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)皮膚毒性以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的促炎反應(yīng)。實(shí)際上，在葡萄膜黑色素瘤的I期臨床試驗(yàn)中觀察到的毒性與預(yù)期一致，包括皮疹、瘙癢、細(xì)胞因子釋放、發(fā)熱、低血壓、惡心和疲勞。此外，隨著重復(fù)給藥，毒性有所降低，因此實(shí)施了患者內(nèi)劑量遞增，以實(shí)現(xiàn)更高暴露量，保障療效。值得一提的是，盡管眼睛中存在目標(biāo)靶點(diǎn)，臨床上尚未觀察到葡萄膜炎。本品已經(jīng)獲批上市。
Roche的Estelle Marrer-Berger博士也分享了pMHC/CD3這類分子in silico和in vitro評(píng)價(jià)方法的使用。與前述內(nèi)容，大同小異，不再贅述。
細(xì)胞因子釋放體外測(cè)試
TGN1412是一種CD28超激動(dòng)劑，在2006年3月進(jìn)行的健康志愿者I期臨床試驗(yàn)中，所有受試者均出現(xiàn)了嚴(yán)重的、危及生命的CRS，部分患者進(jìn)展為多器官功能衰竭。這一事件引發(fā)了廣泛關(guān)注，并推動(dòng)了體外細(xì)胞因子釋放（CRA）試驗(yàn)方法的開發(fā)，并成為TCE分子IND enabling階段必須要開展的關(guān)鍵研究之一。
楊森公司的Daniel Weinstock博士稱，楊森最初為所有在研的抗體類生物藥物開發(fā)了一種固相法，檢測(cè)CRA。然而，這種方法并不適用于CD3雙抗，因?yàn)镃D3能夠有效交聯(lián)，固定化的CD3雙抗檢測(cè)通常呈陽(yáng)性，無(wú)論靶細(xì)胞是否存在。為了克服這一問(wèn)題，楊森開發(fā)了一種新的液相法，使用稀釋1:10的人全血進(jìn)行檢測(cè)。在該實(shí)驗(yàn)中，如果全血中有TAA表達(dá)，CD3雙抗會(huì)引發(fā)濃度依賴性的細(xì)胞因子釋放反應(yīng)。也可以考慮將細(xì)胞因子釋放檢測(cè)納入細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中開展。
安進(jìn)公司的Matthias Friedrich博士分享了該公司在CRA方面的經(jīng)驗(yàn)。他指出，在使用分離的人T細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是液相法還是固相法，在沒(méi)有靶細(xì)胞的情況下均未引發(fā)CRS。安進(jìn)公司目前傾向于在T細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性（TDCC）實(shí)驗(yàn)中測(cè)量細(xì)胞因子釋放。實(shí)驗(yàn)中使用了人和食蟹猴的效應(yīng)細(xì)胞，如果可行，會(huì)使用患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞和自體T細(xì)胞（如TAA表達(dá)外周血）進(jìn)行檢測(cè)。但體外試驗(yàn)的人體預(yù)測(cè)能力有限，猴體內(nèi)細(xì)胞因子釋放與人體更相關(guān)。
然而，有與會(huì)者提出，對(duì)于CD3雙抗，細(xì)胞因子釋放是其預(yù)期的藥理學(xué)作用的一部分。既然如此，為何要對(duì)已知的且風(fēng)險(xiǎn)明確的分子進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別檢測(cè)？FDA的一位代表表示，只要風(fēng)險(xiǎn)已知且在其他研究（藥理學(xué)或毒理學(xué)）中得到確認(rèn)，則無(wú)需進(jìn)行單獨(dú)的CRA。另一位FDA代表指出，當(dāng)T細(xì)胞激活的原因不明時(shí)，通常會(huì)要求對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行CRA，而CD3雙特異性抗體的細(xì)胞因子釋放風(fēng)險(xiǎn)已知，因此通常不需要類似Stebbings-like的CRA。
來(lái)源：藥理毒理開發(fā)
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