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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2025-04-17 20:24
摘 要： 建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定降脂通便膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌含量。樣品用甲醇回流提取后用硫酸水解，用三氯甲烷萃取，以Sepax Bio-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（體積比為23∶42∶35）為流動(dòng)相，流量為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為35 ℃。5種蒽醌的質(zhì)量分別在0.058 8～0.352 8、0.703 6～4.221 6、0.067 2～0.403 2、0.083 6～0.501、0.105 8～0.634 8 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 8，方法檢出限為0.001 5～0.004 2 μg/mL，定量限為0.004 7～0.013 3 μg/mL。樣品加標(biāo)平均回收率為96.47%～98.35%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.0%（n=6）。該方法滿足降脂通便膠囊中5種蒽醌成分的測(cè)定要求，可以為降脂通便膠囊的質(zhì)量控制提供一定的技術(shù)參考。
關(guān)鍵詞： 高效液相色譜法； 降脂通便膠囊； 蒽醌
降脂通便膠囊是由酒大黃、人參、玄明粉、靈芝等6味中藥材組成的中成藥制劑，其功能為瀉熱通便、健脾益氣，用于治療腸胃實(shí)熱、脾氣虧虛所致的大便秘結(jié)、腹脹納呆、形體肥胖、氣短肢倦等癥，或由高血脂導(dǎo)致的上述癥狀。根據(jù)君臣佐使配伍，其中的君藥為酒大黃，酒大黃為大黃的炮制品，大黃的功效為瀉下攻積、逐瘀痛經(jīng)、清熱瀉火、涼血解毒、利濕退黃，用于實(shí)熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、擁腫療瘡、腸擁腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后淤阻、跌打損傷、濕熱痢疾、黃疽尿赤、淋證、水腫等疾病的治療，外治燒燙傷；酒大黃更善于清上焦的血分熱毒，亦可用于目赤咽腫、齒齦腫痛[1]。酒大黃中蒽醌主要功效為瀉下、活血化瘀、抗菌止血功效等，其中具有瀉下功效的成分主要是蒽醌類成分，如大黃酸等。降脂通便膠囊目前執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)[國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-6013 (B-0013)-2014Z]和文獻(xiàn)[2?6]只測(cè)定君藥酒大黃中含有的大黃酚和大黃素的總量，并沒(méi)有測(cè)定酒大黃中其他蒽醌，如大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚的含量?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版一部大黃，測(cè)定了上述5種成分的總量。目前還沒(méi)有同時(shí)測(cè)定上述5種蒽醌的文獻(xiàn)報(bào)道。根據(jù)中醫(yī)整體觀理論，中藥是一個(gè)多成分復(fù)雜體系，其中部分成分并不能全部代表其功效和質(zhì)量，越多的成分表征越能更加全面地對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。筆者參照相關(guān)文獻(xiàn)[7?10]，采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定降脂通便膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌成分的含量，為降脂通便膠囊的質(zhì)量控制提供一定的參考。
1. 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：U3000型，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
分析天平：XS205DualRang型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。
超聲波清洗器：SK5200HP型，昆山市超聲儀器有限公司。
水浴鍋：HH-16型，上海甘易儀器有限公司。
蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為98.3%、99.3%、98.7%、99.2%、99.3%，批號(hào)分別為110758-201817、110757-201607、110756-201512、110796-201621、110757-201607，中國(guó)食品藥品檢定研究院。
甲醇、乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克公司。
磷酸、硫酸、無(wú)水硫酸鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
0.1%磷酸溶液：吸取1 mL磷酸，置于1 000 mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
降脂通便膠囊樣品：市售。
1.2 色譜條件
色譜柱：Sepax Bio-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，蘇州塞分科技股份有限公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器(DAD)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為23∶42∶35)；流量：1 mL/min。
1.3 溶液配制
分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，混合均勻，加入甲醇配制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的質(zhì)量濃度分別為29.4、351.8、33.6、41.8、52.9 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。
1.4 樣品處理
取降脂通便膠囊(批號(hào)為20181105)內(nèi)容物，混勻，取約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，置于80 ℃水浴中回流提取30 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5.0 mL，置于圓底燒瓶中，于80 ℃水浴中揮去甲醇，加入2.5 mol/L硫酸溶液10 mL，超聲處理5 min，使其溶散，再加入三氯甲烷10 mL，于80 ℃水浴中加熱回流60 min，冷卻至室溫，將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，剩余溶液用三氯甲烷重復(fù)提取2次，每次8 mL，合并三氯甲烷液，用無(wú)水硫酸鈉脫水，將三氯甲烷液移至玻璃蒸發(fā)皿中，揮去三氯甲烷，加入甲醇使殘?jiān)耆芙猓瑢⑷芤恨D(zhuǎn)移至10 mL容容量瓶中，加入甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液。
按照降脂通便膠囊制備工藝，制備缺酒大黃藥材的樣品，按樣品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。
1.5 定性、定量方法
在1.2色譜條件下，分別測(cè)定混合對(duì)照品溶液和樣品溶液，根據(jù)5種蒽醌的保留時(shí)間進(jìn)行定性，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。
2. 結(jié)果與討論
2.1 目標(biāo)成分選擇
根據(jù)中醫(yī)理論的整體性和中藥成分的復(fù)雜性，選取降脂通便膠囊制劑中的君藥酒大黃作為研究對(duì)象。選取酒大黃中大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚5種蒽醌類成分作為測(cè)定的目標(biāo)成分，與國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-6013(B-0013)-2014Z相比，增加了蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素甲醚3種成分，能夠更好地體現(xiàn)制劑的質(zhì)量。
2.2 提取方法選擇
酒大黃中蒽醌類成分的提取方法有超聲提取和回流提取[11?14]，水解溶劑有鹽酸溶液和硫酸溶液[15?17]，萃取溶劑有乙醚和三氯甲烷[18?22]。
分別考察了超聲提取和回流提取兩種提取方法。結(jié)果顯示，回流提取后蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌總含量較超聲提取高，故選擇回流提取。
分別考察了鹽酸和硫酸兩種水解溶劑。結(jié)果顯示，硫酸水解用時(shí)較短，而且蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌總含量相對(duì)鹽酸水解較高，故選擇硫酸為水解溶劑。
分別考察了乙醚和三氯甲烷兩種萃取溶劑。結(jié)果顯示，三氯甲烷萃取后蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌總含量比乙醚萃取高，而且三氯甲烷層位于下層，較容易分離，故選擇三氯甲烷為萃取溶劑。
2.3 色譜條件選擇
采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，在波長(zhǎng)254 nm處各組分均有較大紫外吸收，且色譜峰的峰形較好，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm。
分別考察乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液3種不同流動(dòng)相體系時(shí)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為23∶42∶35)為流動(dòng)相時(shí)，各組分出峰時(shí)間適中，分離度符合要求，故選擇流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%磷酸(體積比為23∶42∶35)。
考察色譜柱柱溫分別為20、25、30、35、40 ℃時(shí)的色譜峰形和分離度。結(jié)果表明，在上述溫度下，各組分色譜峰沒(méi)有顯著差別，為保證色譜條件一致，設(shè)置柱溫為35 ℃。
2.4 專屬性試驗(yàn)
精密吸取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按1.2色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，5種蒽醌均能夠很好地分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，陰性樣品溶液在相同保留時(shí)間處沒(méi)有干擾峰，該方法專屬性符合要求。
圖1 混合對(duì)照品溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatograms of mixed reference solution，sample solution，and blank sample solution
2.5 線性方程與檢出限
在1.2色譜條件下，用自動(dòng)進(jìn)樣器依次吸取混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制5種蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，在1.2色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的溶液中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為方法檢出限，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的溶液中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為定量限。5種蒽醌質(zhì)量線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表1。
表1 質(zhì)量線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限
Tab. 1 Linear ranges of mass，linear equations，correlation coefficients，detection limits，and quantification limits
2.6 精密度試驗(yàn)
稱取批號(hào)為20181105的樣品6份，按1.4方法平行制備6份樣品溶液，在1.2色譜條件下分別測(cè)定5種成分的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程計(jì)算5種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.0%，表明該方法精密度良好。
表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 2 Results of precision test
2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)
精密稱取0.1 g樣品，精密加入適量的5種蒽醌對(duì)照品，按樣品溶液制備方法平行制備6份加標(biāo)樣品溶液，在1.2色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 3 Results of sample spiked recoveries test
由表3可知，樣品加標(biāo)平均回收率為96.47%～98.35%，表明該方法準(zhǔn)確度滿足分析要求。
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取同一樣品溶液10 μL，分別在第0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得5種成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～1.0%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 4 Results of stbility test
3. 結(jié)語(yǔ)
建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定降脂通便膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌成分含量。對(duì)目標(biāo)成分選擇、提取方法及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法滿足降脂通便膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌成分的測(cè)定要求，可以為降脂通便膠囊的質(zhì)量控制提供一定的技術(shù)參考。
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來(lái)源：化學(xué)分析計(jì)量
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