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1. 前言

 

相信每一個做過液相色譜實驗的小伙伴，都或多或少被“峰形拖尾”折磨過，峰拖尾是HPLC實驗中最普遍的峰形問題，峰形的對稱性直接影響定量分析的準(zhǔn)確性。那么今天我們就來學(xué)習(xí)一下液相色譜峰拖尾的原因及解決方法。

（圖片來源：參考資料【1】）

 

2 什么是峰拖尾？

 

首先，我們得要搞明白，什么是峰拖尾？

 

簡單來說，就是色譜峰“頭尖屁股寬”，峰的后半部分不對稱了，也就我們所說的拖尾因子Tf>1.2。理想的情況是左右對稱的高斯峰（Tf≈1），而拖尾嚴重時（Tf>2），就有可能造成兩個拖尾峰連在一起，分不開，同時也會導(dǎo)致積分面積算不準(zhǔn)，實驗結(jié)果偏差大。

 

（圖片來源：參考資料【1】）

 

3. 常見原因及解決方法

 

1.色譜柱內(nèi)填料污染或塌陷

 

原因：長期使用色譜柱時，樣品中的強保留物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂類）會逐漸吸附在填料表面，就像“雜質(zhì)糊住了篩網(wǎng)”一樣，影響物質(zhì)正常傳質(zhì)。此外，若操作中頻繁使用極端pH（如pH<2或>8）或高溫條件（>60℃），可能導(dǎo)致硅膠骨架溶解或鍵合相（如C18鏈）脫落，直接破壞填料結(jié)構(gòu)，引發(fā)色譜柱填料塌陷。

 

解決方法：

 

沖洗再生：反向沖洗色譜柱（需確認柱子耐受反向壓力）。

 

使用梯度溶劑沖洗：甲醇→乙腈→0.1M磷酸（pH 2）→純水→高比例有機相（如95%乙腈）。

 

添加保護柱：在分析柱前加上一段保護柱，可以幫助攔截污染物，延長分析柱壽命。

 

更換新色譜柱：若柱效下降超40%或塔板數(shù)明顯降低時，建議直接換柱。

 

2.色譜柱堵塞

 

原因：

 

若樣品未經(jīng)濾膜過濾（如未使用0.22 μm濾膜），其中的微小顆粒物（如細胞碎片、不溶雜質(zhì)）就會直接堆積在柱頭篩板上，阻礙流動相正常通過。此外，若流動相中的緩沖鹽（如磷酸鹽）未完全溶解或久置后析出結(jié)晶，也會卡在篩板孔隙中，進一步加劇堵塞。

 

解決方法：

 

反向沖洗疏通：用純甲醇或乙腈反向沖洗（低流速，如0.2 mL/min）。

 

更換篩板：拆下柱頭篩板超聲清洗（異丙醇中超聲10分鐘）或更換新篩板。

 

預(yù)防措施：

 

○樣品過0.22 μm濾膜，流動相過濾（0.45 μm）。

 

○緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免鹽結(jié)晶。

 

3.進樣量過高

 

原因：

 

當(dāng)樣品進樣量超過色譜柱的承載能力時（尤其是小內(nèi)徑柱或低載量柱），樣品就會局部堆積，導(dǎo)致傳質(zhì)不均。這種過載現(xiàn)象會使色譜峰前沿陡峭、后沿拖拉，形成拖尾。

 

解決方法：

 

減少進樣體積：常規(guī)分析柱（4.6×150 mm）建議進樣量≤10 μL。

 

稀釋樣品：將樣品濃度降低至線性范圍內(nèi)（如稀釋10倍）。

 

換高載量柱：選擇表面修飾更多或粒徑更大的填料柱（如5 μm粒徑替代3 μm）。

 

4.柱外效應(yīng)（系統(tǒng)死體積過大）

 

原因：

 

如果色譜系統(tǒng)的管路過長、接頭尺寸不匹配（比如粗管接細頭）、流通池或進樣閥體積過大，就會導(dǎo)致在色譜柱外的區(qū)域形成額外死體積。死體積過大會導(dǎo)致流動相流速變慢，樣品在死體積處發(fā)生了滯留和擴散，從而形成峰形拖尾。

 

解決方法：

 

優(yōu)化連接管路：

 

○使用內(nèi)徑≤0.13 mm的短管線（如15 cm以內(nèi)）。

 

○更換匹配的PEEK接頭（避免漏液和死體積）。

 

選擇小體積檢測池：流通池體積≤5 μL（如Agilent 1290 Infinity II的1.0 μL池）。

 

減少進樣閥體積：使用低殘留進樣針（如10 μL定量環(huán)替代20 μL）。

 

（圖片來源：參考資料【1】）

 

5.硅羥基效應(yīng)（針對堿性化合物）

 

原因：

 

色譜柱硅膠表面殘留的酸性硅羥基（-SiOH），就像“磁鐵”一樣，會牢牢吸住帶正電的堿性化合物。二者通過離子交換或氫鍵作用，導(dǎo)致化合物滯留在柱子上，最終峰形拖尾。

 

解決方法：

 

添加掃尾劑：

 

○堿性物質(zhì)：流動相加0.1%三乙胺（TEA）或二甲基辛胺（DMOA）。

 

○酸性物質(zhì)：加0.1%三氟乙酸（TFA）或甲酸。

 

調(diào)節(jié)流動相pH：

 

○堿性化合物：pH調(diào)至高于其pKa 2個單位（如pKa=8，則pH=10）。

 

換用特殊色譜模式：

 

○親水相互作用色譜（HILIC）或離子對色譜（IPC）。

 

4. 參考資料

 

【1】http://www.chromclass.com/article/technical-article/chromclass-discussion020/

 

【2】https://lab.jgvogel.cn/c/2023-11-10/1343090.shtml