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該研究的目的是全面考察低 pH 病毒滅活容器的在線清潔效果、密封性、無(wú)菌性、熱穿透性及熱穩(wěn)定性。通過(guò)檢測(cè)在線清潔后淋洗水水樣的各項(xiàng)指標(biāo)，證明清潔效果；通過(guò)保壓試驗(yàn)驗(yàn)證密封性；通過(guò)培養(yǎng)基模擬灌裝以及過(guò)程溫度控制試驗(yàn)證明無(wú)菌性、熱穿透性和熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，清潔后檢測(cè)淋洗水樣，其可見(jiàn)異物、pH 值、電導(dǎo)率、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度、蛋白吸光度的檢測(cè)結(jié)果均符合要求；低 pH 病毒滅活容器的保壓測(cè)試合格；模擬除菌培養(yǎng)基于 (24±1)℃下放置 21 d，模擬病毒滅活，其間罐溫穩(wěn)定在 (24.0±0.2)℃，無(wú)菌性、熱穿透性及熱穩(wěn)定性良好。上述結(jié)果說(shuō)明該低 pH 病毒滅活容器符合生產(chǎn)要求，可確保病毒滅活過(guò)程的可靠性。該研究為低 pH 病毒滅活容器的 GMP 和工藝要求驗(yàn)證提供了參考。

 

《血液制品去除 / 滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》( 國(guó)藥監(jiān)注 [2002]160 號(hào) ) 中指出，為了提高血液制品安全性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除 / 滅活部分病毒能力，生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)有特定的去除 / 滅活病毒方法 [1]。病毒滅活 / 去除是生物制品病毒安全性控制手段之一。多數(shù)藥品監(jiān)管部門(mén)均要求生物制藥企業(yè)適當(dāng)?shù)馗綦x制造過(guò)程，以降低來(lái)自生產(chǎn)工藝步驟、產(chǎn)品批次的殘留污染以及同一工廠生產(chǎn)的不同產(chǎn)品間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn) [2]，因此衍生了不同的病毒滅活 / 去除工藝和隔離策略。在生產(chǎn)制造過(guò)程中，隔離容器作為關(guān)鍵基礎(chǔ)設(shè)備，其性能確認(rèn)和風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)評(píng)估是質(zhì)量控制中不可忽視的重點(diǎn)。低 pH 病毒滅活罐是靜注人免疫球蛋白 (pH 4) 生產(chǎn)的關(guān)鍵設(shè)備之一，通常要求罐內(nèi)制品在 (24±1)℃溫度下恒溫孵放不少于 21 d[3]。本研究對(duì)低 pH 病毒滅活容器 ( 罐 )的清潔效果、密封性、無(wú)菌性、熱穿透性及熱穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)低 pH 病毒滅活容器符合 GMP和工藝要求。

 

 

1.儀器與試藥

 

200 型 低 pH 病毒滅活罐(材質(zhì) S31603；有效容積200 L) 購(gòu)自成都英德生物醫(yī)藥裝備技術(shù)有限公司；UV1800 型紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本 Shimadzu 公 司 )；SevenExcellence S470-B 型多參數(shù)檢測(cè)儀 ( 美國(guó)梅特勒 - 托利多公司 )；衛(wèi)生型隔膜壓力表 ( 精度等級(jí)為 1.6 級(jí)，上海布雷迪儀器儀表有限公司 )；ASMPS107SP 型除菌濾芯 ( 杭州科百特過(guò)濾器材有限公司，0.45/0.2 μm)；DK-8B 型電熱恒溫水浴箱 ( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 )。

 

胰酪胨大豆液體培養(yǎng)基 (TSB，德國(guó)默克公司，批號(hào)VM754559 644)；鱟試劑 ( 湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格為每支 0.25 EU/mL，批號(hào) 2011132)；pH 標(biāo)準(zhǔn)液 (4.01、7.00、9.21) 均購(gòu)自美國(guó)梅特勒 - 托利多公司。

 

2.方法與結(jié)果

 

2.1 設(shè)備確認(rèn)

 

設(shè)備確認(rèn)包括安裝確認(rèn) (installation qualification，IQ)，確認(rèn)儀器文件、部件及安裝過(guò)程；運(yùn)行確認(rèn)(operational qualification，OQ)，確認(rèn)儀器在空轉(zhuǎn)狀態(tài)下，在操作的極限范圍內(nèi)能作正常運(yùn)轉(zhuǎn)；性能確認(rèn) (performance qualification，PQ)，確認(rèn)儀器在載樣運(yùn)行狀態(tài)下是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。結(jié)果顯示，關(guān)鍵的部件得到正確安裝，符合設(shè)計(jì)文件要求。在實(shí)際操作條件下，按照工藝過(guò)程和質(zhì)量控制要求進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)備性能滿足生產(chǎn)需求和質(zhì)量管理部門(mén)的要求。

2.2 驗(yàn)證方法

2.2.1 低 pH 病毒滅活罐在線清潔的驗(yàn)證

配制質(zhì)量濃度為 3％的 TSB 10 L，均勻涂抹在低 pH 病毒滅活罐的內(nèi)表面，模擬制品轉(zhuǎn)出后低 pH病毒滅活罐的未清潔狀態(tài)，放置 12 h 后，進(jìn)行低 pH病毒滅活罐的在線清潔 (clean in place，CIP)，并手動(dòng)沖淋清潔難點(diǎn) ( 包括罐頂、進(jìn)液閥、出液閥、溫度監(jiān)測(cè)孔等 )，收集最后的淋洗水。按照 ChP 2020年版要求，對(duì)可見(jiàn)異物 ( 三部通則 0904)、pH 值( 三部通則 0631)、細(xì)菌內(nèi)毒素 ( 三部通則 1143)、微生物限度 ( 三部通則 1105)、蛋白吸光度 ( 三部通則 0401)、電導(dǎo)率 ( 四部通則 0681) 進(jìn)行檢測(cè)。

低 pH 病毒滅活罐清潔后淋洗水的檢測(cè)結(jié)果如表1 所示。低 pH 病毒滅活罐經(jīng)過(guò) CIP 后，目檢罐體內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的殘留物，淋洗水中可見(jiàn)異物、pH 值、電導(dǎo)率、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度、吸光度均符合要求。

表1 低 pH 病毒滅活罐清潔后淋洗水的檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 低 pH 病毒滅活罐的密封性試驗(yàn)

通過(guò)保壓測(cè)試進(jìn)行密封性試驗(yàn)。將低 pH 病毒滅活罐進(jìn)行組裝并安裝壓力表，然后密閉低 pH 病毒滅活罐的進(jìn)液口、清洗口、出液口、取樣口。將潔凈壓縮空氣注入罐內(nèi)，當(dāng)罐內(nèi)壓力達(dá)到設(shè)計(jì)壓力(0.09 MPa) 時(shí)，停止注入壓縮空氣，密閉進(jìn)氣閥門(mén)，記錄罐內(nèi)起始?jí)毫?。之后，?1 h 記錄 1 次罐內(nèi)壓力，8 h 時(shí)記錄罐內(nèi)最終壓力，并計(jì)算壓力衰減情況，以證明低 pH 病毒滅活罐的密封性符合要求。

結(jié)果顯示，低 pH 病毒滅活罐內(nèi)的壓力在 8 h 內(nèi)均保持 0.09 MPa 不變，可見(jiàn) 8 h 內(nèi)罐內(nèi)壓力衰減值為 0，符合罐內(nèi)壓力衰減在 8 h 內(nèi)≤ 20％的要求。

2.2.3 低 pH 病毒滅活罐的無(wú)菌性挑戰(zhàn)、熱穿透性及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

通過(guò)培養(yǎng)基模擬試驗(yàn)進(jìn)行無(wú)菌性挑戰(zhàn)。同時(shí)監(jiān)測(cè)病毒滅活過(guò)程中的溫度變化，進(jìn)行熱穿透性及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。

配制 3％的 TSB 培養(yǎng)基，經(jīng)除菌濾芯過(guò)濾后，分別加至 2 個(gè)已滅菌的低 pH 病毒滅活罐中，模擬滿載 ( 裝量 200 L，編號(hào) 1) 和半載 ( 裝量 100 L，編號(hào) 2) 狀態(tài)，于 (24±1)℃條件下放置 21 d。模擬試驗(yàn)結(jié)束后，每罐取樣，確認(rèn)培養(yǎng)基樣品無(wú)污染后按照 ChP 2020 年版四部通則 1106 進(jìn)行培養(yǎng)基促生長(zhǎng)試驗(yàn)，以未加菌的培養(yǎng)基管做陰性對(duì)照。逐日觀察，記錄微生物生長(zhǎng)情況。促生長(zhǎng)試驗(yàn)中應(yīng)可觀察到明顯的接種微生物生長(zhǎng)現(xiàn)象，以證明低 pH 病毒滅活罐符合無(wú)菌性要求。

放置期間，監(jiān)測(cè)罐內(nèi)溫度、房間溫度，并記錄最高溫度及最低溫度，以證明低 pH 病毒滅活罐的熱穿透及熱穩(wěn)定性適用于低 pH 病毒滅活。

低 pH 病毒滅活罐的罐溫變化趨勢(shì)如圖 1 所示。模擬試驗(yàn)期間，2 個(gè)罐的培養(yǎng)基最高溫度為 24.2 ℃，最低溫度為 23.3 ℃， 均 落 在 23.0 ～ 25.0 ℃；經(jīng)過(guò)升溫平衡 (D2) 后直至結(jié)束，罐溫均穩(wěn)定在(24.0±0.2)℃，無(wú)明顯溫度異常，符合工藝要求。

圖 1 低 pH 病毒滅活罐內(nèi)的溫度變化趨勢(shì)

 

低 pH 病毒滅活罐的無(wú)菌性試驗(yàn)結(jié)果如表 2 所示。取樣后觀察，培養(yǎng)基為淡黃色澄明液體，無(wú)渾濁、無(wú)絮狀沉淀；取培養(yǎng)基樣品，接種特定菌群( 表 2)，經(jīng)培育后可見(jiàn)明顯的微生物生長(zhǎng)現(xiàn)象。

表2 培養(yǎng)基促生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果

 

3.總結(jié)與討論

 

由于生物制品生產(chǎn)工藝的特殊性，稀釋罐、培養(yǎng)罐、病毒滅活罐等罐體都是生物制品生產(chǎn)中的重要裝備 [3]。應(yīng)用于血液制品的病毒滅活 / 去除方法有低 pH 孵放法、S/D 法、干熱法、巴氏消毒法、辛酸鈉處理法和納米膜過(guò)濾法等 [4—5]。其中，低 pH 孵放法是國(guó)內(nèi)企業(yè)常用的免疫球蛋白類(lèi)產(chǎn)品的病毒滅活方法。該方法不僅能保持免疫球蛋白的活性，同時(shí)可在保證制品病毒安全性方面發(fā)揮重要作用 [6—8]。低 pH 孵放法中，溫度和制品的均一性是非常重要的控制參數(shù)。低 pH 病毒滅活過(guò)程通常在病毒滅活罐內(nèi)進(jìn)行，低 pH 環(huán)境下免疫球蛋白更穩(wěn)定，可避免 IgG的聚合或裂解，且低 pH 孵放法不需增加其他成分去除步驟，在一定溫度范圍內(nèi)保持一段時(shí)間，即可實(shí)現(xiàn)有效的病毒滅活 [9]。

低 pH 病毒滅活罐作為密切接觸制品的無(wú)菌容器，需要對(duì)其清潔效果、無(wú)菌性、密封性、熱穩(wěn)定性以及殘留物進(jìn)行驗(yàn)證及檢測(cè)。其中，容器殘留物的來(lái)源包括：輸液管道、相關(guān)設(shè)備、原液飛沫、氣溶膠等容器的盲端死角等區(qū)域。殘留物的去除是制藥企業(yè)和容器設(shè)計(jì)制造單位關(guān)注的重點(diǎn)項(xiàng)目。ICHQ7[10] 中提出：“應(yīng)采取必要的預(yù)防措施，防止病毒去除 / 滅活前后步驟中可能的潛在病毒污染。”以低 pH 病毒滅活容器為例，在進(jìn)出液接口、罐頂部以及溫度探頭快裝接口 ( 包括 O 形墊圈 ) 處仍存在沾染原液或飛沫后滅活溫度無(wú)法保證，以及因轉(zhuǎn)移引起的滅活不完全等風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究以低 pH 病毒滅活容器 ( 罐 ) 為例，驗(yàn)證 CIP 程序的清潔效果，并對(duì)清潔難點(diǎn) ( 包括罐頂、進(jìn)液閥、出液閥、溫度監(jiān)測(cè)孔等 ) 進(jìn)行手動(dòng)淋洗。結(jié)果顯示，淋洗水的可見(jiàn)異物、pH 值、電導(dǎo)率、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度、蛋白吸光度檢測(cè)結(jié)果均符合要求。同時(shí)，8 h 內(nèi)罐內(nèi)壓力的衰減值為 0( 小于 20％ )，符合密封性要求。模擬除菌培養(yǎng)基于 (24±1)℃下放置 21 d，罐溫均穩(wěn)定在 (24.0±0.2)℃，無(wú)明顯溫度異常；罐內(nèi)培養(yǎng)基為淡黃色澄明液體，無(wú)渾濁、無(wú)絮狀沉淀；取培養(yǎng)基樣接種特定菌群，經(jīng)培育后可見(jiàn)明顯的微生物生長(zhǎng)現(xiàn)象。

綜上所述，現(xiàn)有低 pH 病毒滅活容器，在清潔難點(diǎn)、壓力保持、無(wú)菌性、熱穿透性及熱穩(wěn)定性方面都能得有效控制，符合 GMP 和工藝要求，可保證病毒滅活容器在低 pH 病毒滅活過(guò)程中的穩(wěn)定性和可靠性，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

 

參考文獻(xiàn)

 

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[9] 張 航 , 容新宗 , 黃 琰 , 等．狂犬病人免疫球蛋白低pH 孵放工藝的病毒滅活驗(yàn)證 [J]．中國(guó)生物制品學(xué)雜志 ,2020, 33(11): 1312-1316．

 

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本文作者孟學(xué)科1、尹云云2、麻銀林1、郭雪松2、楊曉東2，1甘肅省藥品監(jiān)督管理局、2國(guó)藥集團(tuán)蘭州生物制藥有限公司，來(lái)源于中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，僅供交流學(xué)習(xí)。