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摘 要：利用液相色譜-質(zhì)譜法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮（AOZ），并對測定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定，分析影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，從而提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。按照GB 31656.13—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)　水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》測定淡水鱸魚中的AOZ，建立數(shù)學(xué)模型，對影響測定結(jié)果的不確定度來源如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、溶液配制、樣品稱量、樣品溶液制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、測量復(fù)性等因素進(jìn)行分析和評定。液相色譜-質(zhì)譜法測定淡水鱸魚中AOZ的結(jié)果為（10.09±1.10） μg/kg，k=2。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及樣品測量重復(fù)性是測量不確定度的主要來源，在檢測過程中應(yīng)加以控制。

關(guān)鍵詞：液相色譜-質(zhì)譜法；淡水鱸魚；3-氨基-2-唑酮；呋喃唑酮代謝物；不確定度

 

呋喃唑酮濫用導(dǎo)致其在淡水鱸魚魚體中殘留，威脅人體健康[1?2]。建立準(zhǔn)確檢測方法評估淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)含量至關(guān)重要。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法作為一種高效、靈敏的分析技術(shù)，在危害物殘留檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3]。該技術(shù)以其良好的分離性能、快速的檢測速度和高敏感度著稱，在檢測復(fù)合材料中微量藥物殘留方面表現(xiàn)出優(yōu)越的適應(yīng)性[4]。在實際應(yīng)用中，由于各種因素的影響，LC-MS法的測量結(jié)果會存在一定的不確定度[5]，因此，對LC-MS法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ的不確定度進(jìn)行評定具有重要意義[6?7]。不確定度評定是實驗室檢測的關(guān)鍵，反映測量結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性[8]，可以幫助檢測人員分析誤差來源，從而減少誤差，提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確度[9?11]。同時，它也是實驗室間數(shù)據(jù)比對和認(rèn)可的重要依據(jù)。

目前國內(nèi)尚無測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ的標(biāo)準(zhǔn)方法，為了提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，確保相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全，筆者采用LC-MS法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ，分析了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、樣品稱量、溶液配制、樣品溶液制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及樣品測量復(fù)性等因素對測定結(jié)果的影響，全面評定其不確定度[12?14]。結(jié)合文獻(xiàn)和試驗數(shù)據(jù)，驗證了評定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[15?16]。該方法可以為食品安全監(jiān)管部門提供科學(xué)依據(jù)，為淡水鱸魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐[17?19]。同時，也可為其他危害物殘留測定結(jié)果的不確定度評定提供參考和借鑒[20]。

 

1.實驗部分

 

1.1主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：QTRAP 4500型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

數(shù)字顯示天秤：XS205DU型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司

離心機(jī)： A-14c型，德國賽多利斯儀器公司。

多管渦旋混勻儀：Multi Reax型，德國海道爾夫公司。

平行濃縮儀：M64型，北京萊伯泰科公司。

超聲波清洗器：XM-5200UVF型，昆山市超聲儀器公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

鹽酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2-硝基苯甲醛：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磷酸氫二鉀、乙酸乙酯：均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 mg/L，Urel=5.0% (k=2)，批號為2202778，上海安譜科學(xué)儀器公司。

AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液：99.6 mg/L，Urel=5.0% (k=2)，批號為S111929，天津阿爾塔科技有限公司。

實驗用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的超純水。

1.2儀器工作條件

1.2.1液相色譜儀

色譜柱：AtiantisTMT3色譜柱[150 mm×2.1 mm，3 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇-0.1%甲酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～1 min時B相體積分?jǐn)?shù)為10%，1～4 min時B相體積分?jǐn)?shù)由10%增加至95%，4～5.5 min時B相體積分?jǐn)?shù)為95%，5.5～6 min時B相體積分?jǐn)?shù)由95%降至10%，6～8 min時B相體積分?jǐn)?shù)保持為10%；流動相流量：0.35 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件

監(jiān)測模式：ESI正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；電噴霧電壓：5 500 V；助燃?xì)夂蛧婌F壓力：0.448 2 MPa；氣體簾幕壓力：0.206 9 MPa；輔助加熱氣溫度：550 ℃。AOZ及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1AOZ及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 1Mass spectrometry parameters of AOZ and internal standard

注：帶*號的為定量離子。

 

1.3溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液： 0.1 μg/mL，準(zhǔn)確量取AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，置于10 mL A級容量瓶中，以甲醇定容至標(biāo)線，配制成AOZ-D4的質(zhì)量濃度為9.96 μg/mL的儲備液。再取此儲備液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，混勻。

AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液： 0.1 μg/mL，精密量取AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線，得到AOZ的質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液至10 mL的容量瓶，用甲醇定容至標(biāo)線，混勻。

AOZ系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1、0.2、0.5、1、2、3 mL，分別置于6只10 mL棕色容量瓶中，均精確加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇稀釋后定容至標(biāo)線，得到AOZ的質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、30 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4樣品處理

稱取適量經(jīng)檢驗為陽性的淡水鱸魚樣品，用粉碎機(jī)粉碎制成肉糜，冷凍密封保存于玻璃容器中。將冷凍的陽性樣品于室溫下解凍，精密稱取2.0 g (精確至0.1 mg)，置于離心管中，精確加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用旋渦混合器混合1 min。隨后加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 mL和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15 mL，再次旋渦混合1 min。將試管置于恒溫振蕩儀中，在37 ℃的條件下，避光振蕩16 h。

取出離心管，冷卻至室溫，用0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液至10 mL玻璃離心管中，在40 ℃下氮氣吹干。加入5% (體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以14 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液即為樣品溶液。

1.5測定方法

按照1.2儀器工作條件，分別測定AOZ系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，以AOZ質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以特征離子色譜峰面積和內(nèi)標(biāo)色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算樣品中AOZ的含量。

 

2.結(jié)果與討論

 

2.1數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)測量原理，建立數(shù)學(xué)模型如式(1)和式(2)所示。

 

(1)

 

(2)

式中：A1——樣品溶液中AOZ的色譜峰面積；

A2——內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積；

B0——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距；

B1——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率，mL/ng；

w——樣品溶液中AOZ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；

V——樣品溶液稀釋總體積，mL；

ρ——樣品溶液中AOZ的質(zhì)量濃度，ng/mL；

m——稱取樣品的質(zhì)量，g；

1 000——換算系數(shù)。

2.2不確定度來源

由測定過程和數(shù)學(xué)模型可知， LC-MS法測定淡水鱸魚中AOZ的不確定度來源主要包括以下6個方面：

(1) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ)；

(2) 溶液配制引入相對標(biāo)準(zhǔn)的不確定度urel(S)；

(3) 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)；

(4) 樣品溶液制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定性urel(X)；

(5) 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)；

(6) 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)。

2.3不確定度評定

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對擴(kuò)展不確定度為5%，k=2，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.2溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)

配制溶液時，用8只10 mL的A級容量瓶，使用0.1 mL移液管2次，使用0.2 mL移液管1次，使用1 mL移液管3次，使用5 mL移液管2次。在整個試驗過程中，內(nèi)標(biāo)溶液的加入量不影響所配制的溶液濃度，所以配制內(nèi)標(biāo)溶液時產(chǎn)生的不確定性不予考慮。容量瓶和移液器體積定值準(zhǔn)確性引入的不確定度和定容溶劑因溫差(校準(zhǔn)溫度為20 ℃，實驗室溫度為25 ℃)產(chǎn)生的體積膨脹引入的不確定度均服從均勻分布，包含因子k=； 5%甲醇溶液中水含量比較高，故其膨脹系數(shù)以水計，水的體積膨脹系數(shù)為0.001 18 mL/℃。由使用的器皿因定值引入的不確定度及定容溶劑因溫差產(chǎn)生的體積膨脹引入的不確定度見表2。

表2溶液配制引入的不確定度

Tab. 2Uncertainty introduced in solution preparation

 

2.3.3樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

連續(xù)取樣2 g樣品共10次，所得平均質(zhì)量為2.003 g。

采用精度為1 mg的XS205DU型電子天平稱量，其檢定的最小分度值e等于10倍的觀測精度，即10 mg。在試驗所涉及的稱量范圍內(nèi)，該電子天平顯示的最大容許誤差限定為其檢定分度值的一半，即0.5倍的e值，計算結(jié)果為5 mg，即0.005 g。此誤差在統(tǒng)計上呈均勻分布，k=，因此天平稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

g

樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(m)＝/＝0.004 56

2.3.4樣品溶液制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

樣品溶液制備過程中，使用1 mL移液管移取5%甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物。由表2可知，1 mL移液管移取1.0 mL 5%甲醇溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(X)===0.006 73

2.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

在1.2儀器工作條件下，測定AOZ系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，結(jié)果見表3。以色譜峰面積和質(zhì)量濃度進(jìn)行最小二乘法擬合，得到線性方程為y=0.233 01x+0.072 17，相關(guān)系數(shù)為0.997。殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差sR按照貝塞爾公式(3)計算，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別按式(4)和式(5)計算。

表3系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測定結(jié)果

Tab. 3Determination results of series standard working solution

 

(3)

 

(4)

 

(5)

式中：sR——標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n2——系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測量次數(shù)，n2=6；

Yj——AOZ與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值；

Aj——第j次測定的AOZ色譜峰面積；

Aj1——第j次測定的內(nèi)標(biāo)色譜峰面積；

B0——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；

B1——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

j——第j次測量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，ng/mL；

n1——樣品溶液的測量次數(shù)，n1=10；

——樣品溶液質(zhì)量濃度平均值，ng/mL；

——系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度平均值，ng/mL；

u(L)——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

urel(L)——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

將表3數(shù)據(jù)代入式(4)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.582 8 ng/mL

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.028 8

2.3.6測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

對樣品溶液平行測定10次，測定結(jié)果表4。

表4樣品溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

Tab. 4Determination results of mass fraction of sample solution

測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u(R)==0.281 7 μg/kg

測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(R)==0.027 9

2.4合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和結(jié)果表示

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量評定結(jié)果見表5。

表5不確定度分量匯總

Tab. 5Summary of uncertainty components

 

上述各不確定度分量彼此獨立不相關(guān)，則合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

rel(w)

= 0.055

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u(w)=×urel(w)=0.55 μg/kg

2.5擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

取置信水平為95%，擴(kuò)展因子k=2，則擴(kuò)展不確定度：

U=k×u(w)=1.10 μg/kg

LC-MS法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ的結(jié)果可表示為(10.09±1.10) μg/kg，k=2。

 

3.結(jié)語

 

液相色譜-質(zhì)譜法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)含量的測量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及樣品測量重復(fù)性。在實驗過程中通過選用高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，規(guī)范并使用高精度的移液器、容量瓶以及天平，提升實驗人員的操作水平，增加平行試驗的次數(shù)，可降低不確定，提高檢測結(jié)果的可靠性。

 

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