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1. 概述

 

阿利新藍(lán)，也叫愛茜藍(lán)、阿爾新藍(lán)等，英文原名Alcian blue，是一種陽離子染料，對(duì)酸性粘液物質(zhì)具有很強(qiáng)的特異性，是對(duì)酸性粘多糖進(jìn)行染色時(shí)最具特異性的染料。染料分子與酸性基團(tuán)形成鹽鍵，利用染料的不同pH及不同電解質(zhì)濃度，可區(qū)分酸性多糖物質(zhì)的類別。

 

 

在這里介紹這一冷門染色劑是因?yàn)?，大家在?shí)驗(yàn)室中最常用的電泳技術(shù)SDS-PAGE在跑完以后通常都要對(duì)蛋白進(jìn)行染色以可視化。

 

眾所周知，蛋白質(zhì)廣泛具有轉(zhuǎn)錄后修飾，糖基化是其中一種，而糖蛋白在生物組織中廣泛存在，對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。而這一轉(zhuǎn)錄后修飾在做WB實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常會(huì)影響條帶的預(yù)期位置與分子量等重要信息。

 

常用的蛋白質(zhì)染色法考馬斯亮藍(lán)和銀染對(duì)糖蛋白檢測(cè)效果并不好，高度糖基化的糖蛋白由于糖鏈干擾銀離子結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致染色效果弱，靈敏度低，甚至無法檢測(cè)。這也是各位同學(xué)在WB實(shí)驗(yàn)中遇到各種玄學(xué)的原因之一。

 

雖然有傳統(tǒng)的PAS染色法，采用Schiff堿反應(yīng)檢測(cè)糖蛋白，其靈敏度也不夠高。因此，對(duì)具有糖基化修飾的蛋白進(jìn)行改良的特異性染色很有必要。

 

在此介紹PAS-AB染色法的進(jìn)一步改良，即過碘酸Schiff-阿利新藍(lán)聯(lián)用，并輔以銀染增強(qiáng)染色效果。

圖源：AB-PAS染色-四川賽因斯特生物科技有限公司

 

2. 染色原理

 

使用高碘酸氧化糖蛋白，以避免阿利新藍(lán)單染糖蛋白顯色微弱；

 

使用阿利新藍(lán)與氧化的糖蛋白結(jié)合以顯示糖蛋白；

 

由于阿利新藍(lán)對(duì)非糖基化蛋白的銀染沒有負(fù)面影響，使用銀染對(duì)非糖基化蛋白進(jìn)行染色，如此操作后，糖基化和非糖基化的蛋白質(zhì)均被染色。

 

染色優(yōu)勢(shì)：

 

可以檢測(cè)SDS凝膠中納克濃度的高度糖基化蛋白，適用于濃度很低的混合樣品及少量純樣品中的糖蛋白檢測(cè)。

 

3. 實(shí)驗(yàn)材料

 

固定液：10%(v/v)三氯醋酸水溶液

 

洗滌液：Ⅰ，25%(v/v)甲醇，10%(v/v)醋酸；Ⅱ，10%(v/v)甲醇，5%(v/v)醋酸；Ⅲ，5%(v/v)醋酸

 

氧化液：1%(w/v)高碘酸

 

還原液：0.5%(w/v)焦亞硫酸鉀

 

染色液：0.125%(w/v)愛茜藍(lán)溶于洗滌液Ⅰ，使用前需過濾

 

光敏處理液：5%(v/v)戊二醛，現(xiàn)用現(xiàn)配

 

顯影儲(chǔ)液：2.5%(w/v)碳酸鈉

 

銀液：0.4%(w/v)硝酸銀，現(xiàn)用現(xiàn)配

 

顯影液：向顯影儲(chǔ)液中加入甲醛至終濃度為0.013%(v/v)，現(xiàn)用現(xiàn)配

 

終止液：10%(v/v)的醋酸、10%(v/v)甘油

 

4. 染色步驟

 

電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移到帶蓋培養(yǎng)皿中，加入固定液，于30℃固定10 min。

 

用洗滌液Ⅲ洗滌凝膠2次，每次2min。然后將凝膠浸沒在氧化液中，于30℃氧化20min，再用洗滌液Ⅲ洗滌凝膠2次，每次2min，再用水洗滌2次，每次2min；加入還原液于30℃還原12min，用水洗滌凝膠2次，每次2min，然后在50℃用洗滌液Ⅰ洗滌凝膠2次，每次2min。

 

加入染色液，于50 ℃染色 15 min。

 

用洗滌液Ⅰ洗滌凝膠3次，時(shí)間分別為1、4、5min，然后用洗滌液在59℃洗滌2次，時(shí)間分別為2、4min。阿爾新藍(lán)在隨后的銀染過程中將被不可逆地固定在凝膠中，形成墨綠色的背景，需用稀醋酸沖洗至背景僅保留微弱的藍(lán)色。

 

加入光敏處理液，于50 ℃處理6 min。

 

用洗滌液Ⅱ洗滌凝膠2次，時(shí)間分別為3、5min，隨后在50 ℃用水洗滌2次，每次2 min。

 

將凝膠浸沒在銀染色液中，于40℃染色6.5 min。

 

于30℃用水洗滌凝膠2次，每次30s。

 

用新鮮配制的顯影液于室溫下顯影30s，產(chǎn)生黑色的沉淀，將凝膠轉(zhuǎn)移到新鮮的顯影液中，再顯影4~8min，具體的顯影時(shí)長需根據(jù)所要求的靈敏度和背景染色情況以及特異性調(diào)整。通常1~3min后可看到糖蛋白，非糖基化蛋白在4~8 min后顯影，按順序?qū)δz進(jìn)行拍照留檔。

 

加入終止液保持5 min，終止顯影。

 

5. 參考文獻(xiàn)

 

[1] 張建社，褚武英，陳韜，2009，蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社