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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-04-27 17:53
背景
蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學(xué) George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analytical Biochemistry 中首次被稱為 Western Blot。最開始做印跡的是一個(gè)叫 Southern 的科學(xué)家，但印跡的對象是 DNA 鏈，他把這種技術(shù)稱為 Southern blot，后來出現(xiàn)了兩個(gè)過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個(gè)針對RNA，一個(gè)對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為 Northern 和 Western，與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒有關(guān)系了。
一：蛋白質(zhì)的樣品制備
由于這一步方法各異，具體步驟請參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是 Western Blotting 的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：
在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。
選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。
防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20 ul 檢測蛋白質(zhì)定量用），然后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 中長期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀沟鞍椎目乖匦园l(fā)生改變。
若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)也應(yīng)注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。
二：蛋白質(zhì)定量
如果要定量的話，一般選擇 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求檢測波長為 562 nm，Bradford 為 595 nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽性結(jié)果，建議先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考馬 G250 混合看是否產(chǎn)生顏色。測完蛋白含量后，計(jì)算含 50～100 ug 蛋白的溶液體積即為上樣量（一般 8 cm 寬的迷你膠每個(gè)泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為 150 ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。
網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個(gè)泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含 loading buffer 的體積）。按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。
上樣總體積一般不超過 15 ul，加樣孔的最大限度可加 20 ul 樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮 3～5 min 使蛋白充分變性。也可以使用 PCR 儀 95° 加熱 5 min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在 4 ℃ 冰箱短時(shí)間保存，也可在 -20℃ 冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。
三：SDS-PAGE 電泳
1. 清洗玻璃板
蘸點(diǎn)洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應(yīng)用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。
2. 灌膠與上樣
① 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。
② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入 TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時(shí)要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。
灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會被沖變形）。
未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。梳子插入濃縮膠時(shí)，應(yīng)確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加 1 cm）。
③ 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時(shí)候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時(shí)間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30 min 左右，AP 不新鮮會導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時(shí)膠是會凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不會超過 1 h，若超過 1 h 甚至更長仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯誤。
由于 TEMED 催化 APS 釋放相關(guān)化學(xué)基團(tuán)，再由 APS 釋放的基團(tuán)催化 Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 不新鮮的話加再多的 TEMED 效果也不佳，這就是為什么推薦 APS 每周新鮮配置的原因。
④ 按說明書配積層膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。
由于膠凝固時(shí)體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
⑤ 趁積層膠聚合的這段時(shí)間，取適當(dāng)體積樣本混合 1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95～100° 加熱 5 min，若有沉淀可用稍低溫度，比如 45~55° 加熱 1 h 達(dá)到變性的目的。我一般習(xí)慣分裝 20 ul 到 PCR 管里，先和 loading buffer 混合好，臨用前用 PCR 儀加熱 95 °C 5 min，效果不錯。
⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣（我們使用的是大連競邁科技公司的 MV-III 型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用 5 ml 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。
目前我們做的 mini 膠上有 10 個(gè)上樣孔，一般在第一個(gè)孔加入 marker（我用的是 Fermentas 預(yù)染 marker），其余 9 個(gè)孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入 marker，中間 8 個(gè)孔加樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長時(shí)間放置的樣品。在未加樣的孔中應(yīng)加入等量的樣品緩沖液。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用 10 ul 的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時(shí)注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。
3. 電泳
電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會破壞緩沖系統(tǒng) pH 的不連續(xù)性。
請各位按照實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來做即可。電泳時(shí)間和電壓說法各異。按照各實(shí)驗(yàn)室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。
電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印
四：轉(zhuǎn)膜
我們實(shí)驗(yàn)室使用的是半干轉(zhuǎn)膜電泳槽。對于轉(zhuǎn)印 90 kd 以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加 SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037 % 的 SDS。
1. 在電泳結(jié)束前 20 min 開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張的濾紙（長一般為 8.1～8.3 cm，寬度根據(jù)裁的膠大小實(shí)際測量，但膠一般會縮水，所以裁 8 cm 就行）和 1 張 PVDF 膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜廴灸?。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1 min～2 min。目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
2. 將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時(shí)候動作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時(shí)一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取 10 ml 注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。
取出凝膠后應(yīng)注意分清上下，可以在右上角裁一個(gè)小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照 marker 指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜，前一種方法更加節(jié)約材料，但操作稍微麻煩了一點(diǎn)。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10 min 左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。
3. 帶上手套，平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上疊放 3 張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF 膜（此時(shí)可在 PVDF 右上角減去一個(gè)角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外 3 張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因?yàn)橐粋€(gè)氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。
用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時(shí)轉(zhuǎn)好幾條膠的時(shí)候更要小心，有一個(gè)膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率）。最后將轉(zhuǎn)移槽的上蓋扣上，接通電源開始轉(zhuǎn)膜。
由于設(shè)備昂貴，第一次操作應(yīng)向熟手請教，否則短路可能燒壞設(shè)備！轉(zhuǎn)完后立即清洗設(shè)備，特別是金屬上蓋，轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬上蓋上形成結(jié)痂，影響設(shè)備的正常使用，我們實(shí)驗(yàn)室今年做 western 的同志因?yàn)楹雎赃@一點(diǎn)，轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。
4. 依據(jù)分子量大小電泳 15～60 min。如果初次轉(zhuǎn)膜，可以根據(jù)一般經(jīng)驗(yàn)，即多少 kD 的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘，再根據(jù)結(jié)果調(diào)整時(shí)間。之后斷開電源，取出轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。
5. 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染。傳統(tǒng)方法是將膜用 1×麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實(shí)際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干，然后浸入 20% 的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此方法僅僅適合 PVDF 膜）。將膜晾干備用。使用預(yù)染 marker 話可以看見 marker 的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個(gè)顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過頭是不可靠的。
五：免疫雜交反應(yīng)
1. 將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h 即可。如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。
2. 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用 TBST 稀釋也可以，當(dāng)然熟練后還可以自由發(fā)揮，配制一些自己的復(fù)方稀釋液）至適當(dāng)濃度（可以在 1.5 ml EP 管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為 1:200，1:500，1:1 000，具體需要預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，用后可回收重復(fù)用 2～3 次，但回收重復(fù)利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應(yīng)在 2～3 天內(nèi)使用，4 度保存，避免反復(fù)凍融。）
撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術(shù)室的病理袋，質(zhì)量不錯，減去下面的折疊部分，用封口器（40～80 元一個(gè)）封上，不漏液即可）。37° 孵育 1 h 之后轉(zhuǎn)移到室溫下再孵育 1 h（或者 4°孵育過夜），用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。也可以多洗幾次，比如 4 次，每次 5 min。
3. 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液（10 ml 足夠了，一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀釋），放在搖床上，室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。選擇好一個(gè)合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，實(shí)踐證明一抗時(shí)間長點(diǎn)可能沒什么關(guān)系，而二抗時(shí)間若過長過短都將會直接影響結(jié)果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。
六：化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影，定影
1. 現(xiàn)在工作臺上鋪一張保鮮膜，將 PVDF 膜放在保鮮膜上。將 ECL 的 A 和 B 兩種試劑在 EP 管內(nèi)等體積混合（注意吸完 A 試劑后吸 B 試劑前要患槍頭），然后均勻滴在 PVDF 膜的蛋白面，反應(yīng) 1～2 min 后，將 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在 X 片夾中預(yù)先鋪好的保鮮膜上一側(cè)，把另一側(cè)翻過來蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。
2. 在暗室中，將 1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X-光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小（比膜的長和寬均需大 1 cm）；打開 X-光片夾，把 X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上 X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為 1 min 到 2 min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果（也有人重疊壓好幾張片，固定曝光 5~10 分鐘，從這好幾張片中選出最合適的底片）；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。
顯影時(shí)間一般為 1~2 min（20～25 ℃），溫度過低時(shí)（低于 16 ℃）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為 5~10 min,以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干（注意：顯影和定影需移動膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響）。
X 光片一般選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)專用柯達(dá) X-OMATBT 膠片 .顯影液和定影液最好每周配置一次，避光室溫保存，顯影和定影液是最便宜的試劑了，千萬不要因?yàn)樗绊懥苏麄€(gè)結(jié)果。
七、凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬請關(guān)注我們下一期內(nèi)容。
主要參考資料
WB 實(shí)戰(zhàn)指南+正確使用 Quantity One定量 by jacqueslm2001
Abcam 的 western 新手指南
土豆網(wǎng)的 western blot 視頻 上海交大出品
《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》精編版 化學(xué)工業(yè)出版社
《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》科學(xué)技術(shù)出版社
milipore 的 western blot 的優(yōu)化方案
Western blot 步步看--網(wǎng)絡(luò)流傳最廣的資料，作者不詳
Bio-rad 蛋白印跡手冊
來源：生物學(xué)霸
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