中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

1. 實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)（CETSA）的核心原理依賴于蛋白質(zhì)對熱穩(wěn)定性的不同響應(yīng)。即配體與靶蛋白結(jié)合后，可提高蛋白的熱穩(wěn)定性，使其在相同溫度下相比于天然蛋白更不容易發(fā)生變性。

相較于未結(jié)合藥物的游離蛋白，這類受配體保護(hù)的蛋白在同一溫度條件下能保持較高比例的天然結(jié)構(gòu)，從而減少降解產(chǎn)物的產(chǎn)生。

（圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Cellular_thermal_shift_assay）

實(shí)驗(yàn)過程中，通過在不同溫度條件下檢測蛋白的完整性或溶解性，可以間接評估藥物與靶蛋白的結(jié)合情況。這種方法廣泛用于鑒定小分子藥物的作用靶點(diǎn)，研究蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制，并在藥物篩選和機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

耗材：10cm培養(yǎng)皿、6cm培養(yǎng)皿、PCR管、6孔板

試劑：NP-40緩沖液、蛋白酶抑制劑、2×SDS Loading Buffer、SDS-PAGE凝膠試劑、DMSO

儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、PCR儀、離心機(jī)

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

培養(yǎng)293T細(xì)胞，確保狀態(tài)良好，鋪6孔板，密度大約在70%左右，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染目的蛋白質(zhì)粒。

3.2 藥物孵育

隨后將細(xì)胞暴露于DMSO或?qū)嶒?yàn)藥物X中，37℃培養(yǎng)24 h，以確保藥物能夠充分與靶蛋白結(jié)合。

3.3 細(xì)胞收集與預(yù)處理

孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞并用含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L PMSF或者50×cocktail）的PBS清洗2次。胰酶消化后離心棄上清，將細(xì)胞重懸于PBS（不含蛋白酶抑制劑）中，細(xì)胞計(jì)數(shù)以調(diào)整細(xì)胞密度至2×10? cells/mL。

3.4 溫度梯度處理

將細(xì)胞均分至多個(gè)PCR管中（50 μL），確保每管含有等量的細(xì)胞。使用PCR儀或加熱裝置，在一系列不同溫度梯度（如37℃至67℃）下加熱3 min，室溫冷卻3 min，并在冰上保持，使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的熱變性（做3個(gè)重復(fù)）。

3.5 細(xì)胞裂解與蛋白提取

熱處理結(jié)束后，使用NP-40緩沖液重懸細(xì)胞，并通過液氮凍融循環(huán)3次，以徹底裂解細(xì)胞并釋放蛋白質(zhì)。然后，在4℃條件下，以20,000×g離心20 min，收集上清液，其中富含未變性的蛋白，而沉淀部分主要包含已變性的蛋白。

3.6 蛋白檢測

取20 μL上清液，與等量的2×SDS Loading Buffer混合，在金屬浴中加熱煮蛋白10 min，使蛋白充分變性。之后可進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測目標(biāo)蛋白的含量。如果需要更精細(xì)的蛋白質(zhì)分析，可將上清送至專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，以解析蛋白的穩(wěn)定性及藥物作用機(jī)制。

如圖為將裂解物與100μmol/L Dem一起孵育5-10 min，發(fā)現(xiàn)Dem在所有溫度下都顯著促進(jìn)了USP22蛋白的降解，甚至在室溫下也是如此。 圖片

如圖為CETSA用于測定USP22與Dem（一種藥物）在短時(shí)間藥物暴露（5 min）下的一系列溫度范圍內(nèi)相互作用的熱不穩(wěn)定性[1]

4. 注意事項(xiàng)

作為對照組使用的DMSO，其終濃度應(yīng)控制在不影響細(xì)胞生長的范圍（通常≤0.1%）；

加熱時(shí)間：通?？刂圃?-5 min，時(shí)間過短可能導(dǎo)致蛋白未充分變性，過長可能引起非特異性降解；

NP-40或Triton X-100緩沖液可用于溫和裂解，避免使用過強(qiáng)的裂解條件（如SDS），否則可能影響蛋白的穩(wěn)定性；

液氮凍融即將8連排管緩慢放入液氮冷凍1-2 min，取出后迅速置于37℃恒溫水浴鍋使其融化，重復(fù)操作，共3次。

5. 參考資料

[1]Zhang Y, Huang Y, Yu D, Xu M, Hu H, Zhang Q, Cai M, Geng X, Zhang H, Xia J, Guo M, Lu D, Xu H, Li L, Zhang X, Wang Q, Liu S, Zhang W. Demethylzeylasteral induces PD-L1 ubiquitin-proteasome degradation and promotes antitumor immunity via targeting USP22 [J]. Acta pharmaceutica Sinica B, 2024, 14(10): 4312-4328.