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1.概述

 

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局食品藥品審核查驗(yàn)中心（CFDI）于2025.1.17發(fā)布《清潔驗(yàn)證技術(shù)指南》[1]，該指南詳細(xì)描述了清潔驗(yàn)證執(zhí)行過程中的各項(xiàng)要求，以指導(dǎo)和規(guī)范藥品上市許可持有人、藥品生產(chǎn)企業(yè)（包括原料藥登記人）等對(duì)藥品生產(chǎn)設(shè)備及部件的清潔驗(yàn)證進(jìn)行科學(xué)管理，確?；颊哂盟幇踩?。眾所周知，藥品生產(chǎn)設(shè)備在生產(chǎn)結(jié)束后，需按照規(guī)定的清潔程序進(jìn)行清潔。設(shè)備上的殘留物必須達(dá)到規(guī)定的清潔限度要求，才不會(huì)對(duì)接下來生產(chǎn)的產(chǎn)品造成交叉污染。而確定殘留物是否達(dá)到規(guī)定的清潔限度要求，離不開對(duì)殘留物進(jìn)行檢驗(yàn)。因此，建立準(zhǔn)確可靠的清潔驗(yàn)證后殘留物分析方法會(huì)對(duì)判定設(shè)備清潔程度起到舉足輕重的作用。本文筆者將論述清潔驗(yàn)證后殘留物分析方法開發(fā)與驗(yàn)證要點(diǎn)，以便為廣大研究者在清潔驗(yàn)證分析方法建立方面提供參考。

 

2.殘留物分析方法開發(fā)

 

設(shè)備表面在生產(chǎn)時(shí)會(huì)有少量樣品殘留，再經(jīng)過清洗、清潔，殘留的量會(huì)更少，且設(shè)備經(jīng)過清潔后也會(huì)有少量的清潔劑殘留。企業(yè)一般規(guī)定殘留限度為10ppm甚至更低。由于殘留量低，常量分析無法達(dá)到，只能采用半微量分析、微量分析甚至痕量分析，所以需要開發(fā)滿足需求的檢測(cè)方法。如果分析方法選取不當(dāng)，靈敏度低，殘留量有可能低于檢測(cè)限而不易檢出。

 

2.1 殘留物分類

 

確定殘留物類型、性質(zhì)甚至結(jié)構(gòu)是開發(fā)殘留物分析方法的基礎(chǔ)和前提，其中，對(duì)殘留物進(jìn)行分類是第一步：按照測(cè)試對(duì)象可分為中間體、活性成分、輔料和清潔劑；按照殘留物的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)可分為有紫外吸收的化合物和無紫外吸收的化合物。

 

2.2 分析方法的選擇原則

 

殘留物分析方法的選擇常遵循四項(xiàng)原則：高靈敏度、盡可能高的取樣回收率、良好的精密度和簡(jiǎn)單快速。

 

2.2.1 高靈敏度：

 

由于殘留物限度較低，所選擇的分析方法必須有高靈敏度；

 

2.2.2 盡可能高的取樣回收率：

 

殘留物分析方法往往存在取樣回收率較低的問題，即使具有同樣的表面殘留量，取樣后樣品的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有很大差異，故《藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南》規(guī)定取樣回收率和方法回收率的綜合回收率不低于50%，多次取樣的回收率的RSD不大于20%，對(duì)于回收率的要求較寬松。而實(shí)踐中，取樣回收率大約在70%-85%，而RSD一般在5%-15%。建議選擇的分析方法，其取樣回收率在75%以上，RSD不大于10%，盡可能提高分析方法的準(zhǔn)確度；

 

2.2.3 良好的精密度：

 

樣品取樣回收率較低已經(jīng)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度產(chǎn)生了影響，如果分析方法精密度差，檢測(cè)誤差容易產(chǎn)生疊加，產(chǎn)生更大的誤差，這就失去了檢測(cè)監(jiān)控的意義，所以分析方法必須有良好的精密度；

 

2.2.4 簡(jiǎn)單快速：

 

許多企業(yè)都是連續(xù)性生產(chǎn)，生產(chǎn)結(jié)束后清場(chǎng)、清潔、取樣檢驗(yàn)，需要很快知道清潔效果和確定是否可以繼續(xù)生產(chǎn)下一批產(chǎn)品，這就需要檢驗(yàn)的及時(shí)快速，而這就取決于分析方法是否簡(jiǎn)單快速。

 

此外，分析方法的選擇還應(yīng)考慮到可用的儀器、檢測(cè)技術(shù)的專屬性、取樣限制（包括取樣溶劑）、響應(yīng)值是否呈線性、能否在線檢測(cè)、檢驗(yàn)成本等因素。

 

2.3 分析方法類型

 

2.3.1 常用分析方法

 

常用的分析方法可以分為專屬性方法和非專屬性方法。前者的典型代表為高效液相色譜法，后者的典型代表為總有機(jī)碳法。常用的分析方法見表1。

 

▲表1-常用的分析方法

 

2.3.2 其他分析方法

 

除常用的分析方法，基于不同的產(chǎn)品類型，亦可在殘留物分析時(shí)采用表2中的方法或表中未列出的其他方法。

 

▲表2-常見的其他分析方法

 

2.3.3 微生物和細(xì)菌內(nèi)毒素分析方法

 

微生物殘留的控制也是清潔驗(yàn)證的一個(gè)重要部分。微生物殘留包括生物負(fù)載和細(xì)菌內(nèi)毒素。通常，如果下一個(gè)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，應(yīng)當(dāng)在清潔驗(yàn)證中進(jìn)行該項(xiàng)目的檢測(cè)，分析方法通常是藥典方法（藥典四部通則1143[2]）。如不進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)需要進(jìn)行科學(xué)的評(píng)估。

 

2.4 分析方法的選擇

 

2.4.1 基于方法的專屬性

 

分析方法的選擇取決于清潔后的殘留物性質(zhì)，應(yīng)當(dāng)考慮清潔過程中活性成分是否發(fā)生變化（如降解）?；钚猿煞秩绻窗l(fā)生變化，首選專屬性分析方法；活性成分如果發(fā)生變化，則應(yīng)當(dāng)選擇專屬性和非專屬性兩個(gè)方法。如果只能采用非專屬性分析方法，應(yīng)當(dāng)經(jīng)過充分評(píng)估和論證。

 

基于全生命周期管理的原則，在清潔驗(yàn)證的不同階段可能使用不同的分析方法來評(píng)價(jià)殘留物。開發(fā)階段早期，可能還未獲得殘留物的足夠信息（例如活性成分是否降解），并且特定的分析方法可能也尚未經(jīng)過驗(yàn)證。清潔工藝開發(fā)時(shí)，可采用電導(dǎo)率、pH或者總有機(jī)碳法（TOC）等具有良好耐用性和通用屬性的非專屬性方法，并且這些方法對(duì)包括殘留標(biāo)記物在內(nèi)的大部分成分也會(huì)有響應(yīng)。

 

2.4.2 基于殘留物的性質(zhì)

 

對(duì)于有紫外吸收的化合物，可以采用紫外-可見分光光度法，亦可采用高效液相色譜法。對(duì)于單一化合物，分析方法開發(fā)時(shí)，如果已有該化合物的紫外或高效液相的檢測(cè)方法時(shí)，可以直接采用，如目標(biāo)殘留物為活性成分，可直接采用含量測(cè)定的方法，但是必須再次實(shí)施方法驗(yàn)證，重點(diǎn)考查檢測(cè)限或定量限能否達(dá)到要求。如果能夠達(dá)到要求，且吸光度滿足準(zhǔn)確度驗(yàn)證的要求，最好采用紫外分光光度法，如果采用高效液相色譜法，方法開發(fā)投入的時(shí)間會(huì)很多，比如色譜柱、流動(dòng)相類型、流動(dòng)相的pH值、緩沖鹽濃度的選取等；如果已有的檢測(cè)方法的檢測(cè)限或定量限無法達(dá)到要求，則需調(diào)整分析方法或更換其他分析技術(shù)，直至靈敏度達(dá)到要求，例如，有研究者在開發(fā)阿西替尼清潔驗(yàn)證殘留物分析方法時(shí)，其API殘留分析方法借鑒阿西替尼含量測(cè)定方法的HPLC色譜條件，在該色譜條件上進(jìn)行了進(jìn)樣量的調(diào)節(jié)、色譜柱的改變、梯度的調(diào)整，以及根據(jù)清潔驗(yàn)證擦拭取樣的特點(diǎn)進(jìn)行了擦拭方法的篩選，最后完成了線性、定量限、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、精密度和專屬性的驗(yàn)證，從而建立了符合要求的清潔驗(yàn)證中阿西替尼殘留分析方法[3]。對(duì)于復(fù)方制劑，考慮到專屬性，建議優(yōu)先使用高效液相色譜法。只有一種特例可以使用紫外分光光度法測(cè)定，那就是組分之間的吸收峰不互相干擾，吸收波長(zhǎng)差異較大，則可以將不同組分在不同波長(zhǎng)下分開測(cè)定[4]。

 

對(duì)于無紫外吸收的化合物,有以下五種測(cè)定方法可供選擇：

 

（1）采用紫外-可見分光光度法中的比色法。比色法是指供試品本身在紫外- 可見光區(qū)沒有強(qiáng)吸收，可加入一定量的顯色劑與供試品反應(yīng)，使反應(yīng)產(chǎn)物在紫外或可見光區(qū)有強(qiáng)吸收，此過程也稱顯色反應(yīng)。由于過程是化學(xué)過程，顯色劑的選擇至關(guān)重要，檢測(cè)時(shí)還得考慮顯色劑的用量；溶液酸度對(duì)顯色反映的影響；反應(yīng)溫度；反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)的可逆性等眾多因素，此外此方法無法對(duì)殘留物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，所以這種方法一般不被企業(yè)所采用。

 

（2）對(duì)待測(cè)物進(jìn)行柱前衍生，以提高其在紫外-可見光區(qū)的響應(yīng)。此方法與上述比色法原理相同，即加入帶有發(fā)色基團(tuán)的衍生試劑與待測(cè)物反應(yīng)，生成穩(wěn)定的、具有紫外吸收的物質(zhì)，進(jìn)而可通過液相色譜法（紫外檢測(cè)器）或紫外-可見分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。例如，胺類物質(zhì)常用酰氯類（對(duì)甲苯磺酰氯、苯甲酰氯、Fmoc-Cl等）或醛類（苯甲醛、對(duì)二甲基苯甲醛等）作為衍生試劑。柱前衍生法雖然可提高待測(cè)物的紫外響應(yīng)，但是存在操作較繁瑣、對(duì)反應(yīng)條件要求高、有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物，引入其他雜質(zhì)，給色譜分離帶來困難和有時(shí)重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，因此不建議將此法作為優(yōu)先選項(xiàng)。

 

（3）對(duì)于沸點(diǎn)低、易氣化和熱穩(wěn)定性好的化合物可采用氣相色譜法。氣相色譜儀的檢測(cè)靈敏度可以滿足大多數(shù)清潔驗(yàn)證殘留物質(zhì)的檢測(cè)，限度為2ppm都可以滿足。氣相檢測(cè)方法在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證時(shí)，如果采用頂空進(jìn)樣，需要考慮氣液平衡過程中的基質(zhì)效應(yīng)(供試品溶液與對(duì)照品溶液組成差異對(duì)頂空氣-液平衡的影響)，進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證時(shí)，可采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)加入法可以消除供試品溶液基質(zhì)與對(duì)照品溶液基質(zhì)不同所致的基質(zhì)效應(yīng)的影響。

 

（4）對(duì)于沸點(diǎn)高、難氣化或熱穩(wěn)定性差的化合物可采用液相色譜串聯(lián)其他檢測(cè)器法，如ELSD、CAD、MS。其中ELSD和CAD為質(zhì)量型檢測(cè)器，理論上對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)，且這兩種檢測(cè)器靈敏度較紫外檢測(cè)器更高，而MS的靈敏度和分辨力極高，在痕量物質(zhì)的檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用。但以上幾種檢測(cè)器的線性范圍較窄，耐用性不如紫外檢測(cè)器高，在實(shí)際開發(fā)方法過程中，可與第二種柱前衍生法對(duì)比研究，以選出最適合的方法。

 

（5）采用TOC法進(jìn)行測(cè)定。TOC法常用來檢測(cè)制藥用水中的有機(jī)碳總量，用以間接控制水中有機(jī)物含量。2005年,FDA提出制藥行業(yè)TOC方法檢測(cè)清潔后的殘留物是可行的[5]。有研究者用TOC法實(shí)現(xiàn)了注射用奧美拉唑鈉清潔后殘留奧美拉唑的測(cè)定，他們用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定殘留奧美拉唑，結(jié)果表明奧美拉唑呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，無論是噴淋清潔還是棉簽擦拭清潔后奧美拉唑殘留量均符合要求[5]。然而，此法用于測(cè)定殘留物仍有一定的局限性，殘留化合物在水中應(yīng)具有一定的溶解度，而且測(cè)定時(shí)需要快速，樣品從取樣到檢測(cè)不宜超過30min。另外，樣品須密封保存，防止空氣中CO2的進(jìn)入而影響測(cè)定結(jié)果。方法驗(yàn)證時(shí)，線性測(cè)試由于受到外部干擾，所以TOC法一般用于限度檢查，對(duì)于定量測(cè)定還是有一定難度。

 

3.分析方法驗(yàn)證

 

殘留物的分析方法應(yīng)該在清潔驗(yàn)證開始之前，即清潔工藝確認(rèn)前，就完成其自身的分析方法驗(yàn)證，才能給設(shè)備清潔驗(yàn)證過程殘留物的檢驗(yàn)和結(jié)果的準(zhǔn)確判定提供依據(jù)。如果引用藥典方法，由于清潔檢測(cè)的含量水平較低，其響應(yīng)值、精密度等指標(biāo)可能會(huì)與藥典方法不同，也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)項(xiàng)目的驗(yàn)證。細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法通常是藥典方法，無需進(jìn)行方法驗(yàn)證，確認(rèn)其適用性即可。對(duì)于成分較為復(fù)雜產(chǎn)品（如含有螯合劑、表面活性劑等），則需進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)的研究。

 

清潔驗(yàn)證的重點(diǎn)之一是確定殘留限度（限度的計(jì)算方法詳見《清潔驗(yàn)證技術(shù)指南》中4.5章節(jié)，筆者也將在后續(xù)文章中分享相關(guān)內(nèi)容，故在此不做贅述），然后使用分析方法測(cè)定清潔后設(shè)備表面的殘留，分析方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。分析方法的驗(yàn)證應(yīng)按照《中國(guó)藥典》的要求進(jìn)行，通常驗(yàn)證性能特征有準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、響應(yīng)（線性、非線性、多變量）、范圍、范圍下限（定量限、檢測(cè)限）和耐用性等，詳見表3。定量限/檢測(cè)限必須低于樣品的可接受限度，以確保清潔程序的耐用性?？紤]到取樣樣品和檢測(cè)間隔有一定時(shí)間，還應(yīng)當(dāng)評(píng)估貯存條件（時(shí)間、溫度、貯存的小瓶等）對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響。專屬性方法還應(yīng)關(guān)注干擾物（如清潔劑等）可能帶來的影響。值得一提的是，準(zhǔn)確度驗(yàn)證中除了方法本身回收率外，還應(yīng)包括取樣回收率，如棉簽擦拭回收率、沖洗后不銹鋼板回收率等。

 

對(duì)于使用定性方法來進(jìn)行清潔驗(yàn)證時(shí)，可不進(jìn)行全面的分析方法驗(yàn)證。其準(zhǔn)確性和精密度通常只需在殘留限度水平進(jìn)行，無需進(jìn)行線性和范圍的驗(yàn)證。

 

使用TOC 法測(cè)定時(shí)，如果結(jié)果大于500ppb，需建立線性范圍等證明TOC 方法的適用性。

 

▲表3-清潔驗(yàn)證中殘留物分析方法驗(yàn)證項(xiàng)目

 

+表示此項(xiàng)特征通常需要評(píng)價(jià)；-表示此項(xiàng)特征通常不需要評(píng)價(jià)。

 

設(shè)備清潔殘留物的分析方法經(jīng)過驗(yàn)證后，同樣要遵循分析方法生命周期管理的原則[6]，當(dāng)情況發(fā)生改變時(shí)要進(jìn)行再驗(yàn)證，如分析技術(shù)的變更、待分析物的變化、生產(chǎn)工藝的改變或清潔工藝的改變等，都可能影響原分析方法確定待分析物水平的準(zhǔn)確性，分析方法也需要隨之進(jìn)行部分或完全再驗(yàn)證[7]。

 

4.結(jié)語(yǔ)

 

本文筆者以《清潔驗(yàn)證技術(shù)指南》為基礎(chǔ)，結(jié)合其他文獻(xiàn)，總結(jié)了清潔驗(yàn)證后殘留物分析方法開發(fā)與驗(yàn)證要點(diǎn)，為廣大同行提供思路。生產(chǎn)設(shè)備清潔程度的判定離不開準(zhǔn)確可靠的殘留物分析方法，建立持續(xù)可行的清潔驗(yàn)證殘留物分析方法，將為生產(chǎn)工藝持續(xù)高效運(yùn)轉(zhuǎn)提供堅(jiān)實(shí)保障。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] CFDI：《清潔驗(yàn)證技術(shù)指南》.

 

[2]《中國(guó)藥典》四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法.

 

[3] 賀佩蘭. 阿西替尼及其清潔驗(yàn)證中殘留物的HPLC分析方法研究[D]. 浙江工業(yè)大學(xué)，2019.

 

[4] 管玉華，徐春明. 藥品清潔驗(yàn)證中殘留物檢測(cè)的分析方法選擇[J]. 中國(guó)醫(yī)療前沿，2013, 8(22): 92-92, 96.

 

[5] 李明，曲楠楠，董春柳. TOC分析方法在制藥設(shè)備清潔驗(yàn)證中的應(yīng)用舉例[J]. 生物技術(shù)世界，2016, (2): 201.

 

[6] ICH Q2(R2): Validation of Analytical Procedures.

 

[7] 陳雯秋. 清潔驗(yàn)證中的分析方法學(xué)驗(yàn)證[J]. 中國(guó)藥業(yè)雜志，2005, 14(4): 17-19.