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雙光子顯微鏡（Two-photon microscope，TPM）作為一種基于非線性光學(xué)效應(yīng)的高分辨率三維成像技術(shù)，近年來在化妝品功效評(píng)價(jià)領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著的應(yīng)用潛力。其核心優(yōu)勢(shì)在于無創(chuàng)、在體、原位、無標(biāo)記的實(shí)時(shí)成像能力，能夠深入皮膚組織觀察細(xì)胞及胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，為化妝品的安全性和功效性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。以下是其具體應(yīng)用及技術(shù)特點(diǎn)：

 

一.技術(shù)原理與優(yōu)勢(shì)

 

1. 深層成像能力

雙光子顯微鏡利用長(zhǎng)波長(zhǎng)（通常780-1300nm）激光激發(fā)，減少組織散射和吸收，成像深度可達(dá)200μm以上（單光子共聚焦顯微鏡僅約100μm，三光子顯微鏡可達(dá)500μm左右），能夠清晰呈現(xiàn)皮膚表皮至真皮淺層的結(jié)構(gòu)。

例如，可觀察到角蛋白、膠原纖維、彈性纖維、黑色素等物質(zhì)的分布，以及NAD(P)H/FAD等代謝標(biāo)志物的自發(fā)熒光信號(hào)。

圖1. 角質(zhì)層：典型的角質(zhì)層圖像特點(diǎn)是呈現(xiàn)不規(guī)則狀，邊緣清晰，能觀察到暗溝或亮線

圖2. 顆粒層：由稍微扁平的角質(zhì)形成細(xì)胞組成，可以觀察到明顯的細(xì)胞、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，觀察是否排列規(guī)整，無空洞缺損部位

圖3. 棘層：由多邊形的角質(zhì)形成細(xì)胞組成，可以觀察到蜂巢狀緊密排列的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多邊形。與顆粒層相比，棘層的細(xì)胞大小顯著減小

圖4. 基底層：基底細(xì)胞色素環(huán)包裹真皮乳頭，在3D層掃時(shí)可以觀察到環(huán)形結(jié)構(gòu)，環(huán)形結(jié)構(gòu)內(nèi)部一般是膠原纖維，環(huán)繞在膠原纖維周圍的一圈細(xì)胞為基底細(xì)胞層

圖5. 真皮層彈性纖維：在基底細(xì)胞層下方觀察到，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，采集時(shí)需注意到達(dá)此層若出現(xiàn)毛囊空洞需重新采集

圖6. 真皮層膠原纖維：紋理結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)條帶狀或網(wǎng)狀，采集時(shí)需注意到達(dá)此層若出現(xiàn)毛囊空洞需重新采集

（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室）

 

2. 高分辨率與多模態(tài)成像

• 水平分辨率≤0.8μm，可分辨單個(gè)細(xì)胞及胞外基質(zhì)形態(tài)（如膠原纖維的排列）。

• 結(jié)合雙光子熒光（TPEF）和二次諧波（SHG）技術(shù)，分別檢測(cè)代謝物質(zhì)，如NAD(P)H和膠原纖維，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)量化分析。

3. 無創(chuàng)性與實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

• 無需切片或染色，避免傳統(tǒng)組織學(xué)方法對(duì)樣本的破壞，支持同一部位長(zhǎng)期追蹤，適用于化妝品功效的時(shí)間序列評(píng)價(jià)。

圖7. a) 傳統(tǒng)顯微觀察：需切片+染色（圖源來自網(wǎng)絡(luò)）

圖7. b) 雙光子顯微鏡：雙通道天然水平光學(xué)切片成像

（圖源來自CIRS化妝品功效臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室）

注：雙通道指自發(fā)熒光通道：角蛋白（角質(zhì)層）、NAD(P)H&FAD（活角質(zhì)形成細(xì)胞）、彈性纖維（網(wǎng)狀真皮層）、黑色素（基底層）；二次諧波通道：膠原纖維（網(wǎng)狀真皮層）。

 

二.在化妝品功效評(píng)價(jià)中的具體應(yīng)用

 

1. 皮膚屏障與保濕功效評(píng)估

• 通過監(jiān)測(cè)角質(zhì)層厚度、細(xì)胞間脂質(zhì)排列及水分分布，評(píng)估保濕類產(chǎn)品的修復(fù)效果。例如，對(duì)比使用產(chǎn)品前后皮膚表層角蛋白熒光強(qiáng)度的變化，量化保濕效果。

圖8. a) 使用產(chǎn)品28天后，角質(zhì)層表層形態(tài)趨于平整（可見空洞減少，角質(zhì)層形成細(xì)胞排列趨于均勻）

圖8. b) 使用產(chǎn)品28天后，上表層逐漸增厚（虛線為真表皮交界處）

（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室）

2. 微針創(chuàng)傷檢測(cè)

利用醫(yī)美微針壓刺手臂皮膚之后，用雙光子檢測(cè)微針創(chuàng)口。

 

 

圖9. 角質(zhì)層存在明顯的不規(guī)則創(chuàng)口，網(wǎng)狀纖維層對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)無信號(hào)區(qū)，說明微針刺穿了基底層

（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室）

3. 抗衰老與緊致功效研究

• 膠原纖維成像：SHG通道可直觀顯示膠原纖維的密度和排列變化，評(píng)估抗皺產(chǎn)品的功效。

圖10. SHG通道膠原纖維—平面圖像

 

D0

 

D28

 

圖11. SHG通道膠原纖維—立體圖像

（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室）

 

注：

 

- 膠原纖維屬于功能性蛋白質(zhì)，較粗大，直徑1~20μm成束狀分布，排列緊密，并交織成網(wǎng)狀。

 

- 雙光子膠原纖維的掃描可觀察深度一般為40μm，甚至更深。

 

- 可以在二次諧波通道觀察到膠原纖維（紅色），平面圖像主要特征為紋理結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)條帶狀或網(wǎng)狀，立體圖像由于不同深度的膠原纖維疊加，主要呈現(xiàn)為立體網(wǎng)狀或蓬松的云狀結(jié)構(gòu)。

 

圖12. 監(jiān)測(cè)表皮層厚度變化

 

注：隨回訪周期變化：使用產(chǎn)品28天后，上表皮厚度顯著改善8.45%；0μm處為角質(zhì)層表面；0~40μm處為表皮層；50~60μm處（圖示虛線處）為真表皮交界處，紅色膠原纖維出現(xiàn)處，可認(rèn)為是真皮最淺，綠色細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失處，可認(rèn)為是表皮最深；60~120μm處為真皮淺層，紅色信號(hào)為膠原纖維，綠色信號(hào)為彈性纖維。

 

 

圖13. 熒光通道&二次諧波通道—立體圖像

（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室）

 

• 代謝活性分析：NAD(P)H/FAD熒光強(qiáng)度比值反映細(xì)胞代謝狀態(tài)，間接評(píng)價(jià)抗氧化和抗衰老效果。

 

4. 安全性評(píng)價(jià)

 

•觀察化妝品成分對(duì)皮膚細(xì)胞的光毒性或炎癥反應(yīng)（如細(xì)胞形態(tài)異常、熒光信號(hào)異常增強(qiáng)）。

 

三.行業(yè)應(yīng)用方向

 

化妝品功效評(píng)價(jià)應(yīng)用方向：化妝品人體功效方法開發(fā)，如基于雙光子激發(fā)技術(shù)的皮膚纖維形態(tài)測(cè)試方法的探究，并將其應(yīng)用于人群皮膚基礎(chǔ)調(diào)研，文獻(xiàn)有記載雙光子分析真皮纖維網(wǎng)格的形態(tài)特征隨年齡的變化，并定義了真皮形態(tài)學(xué)評(píng)分體系MDMS（MLT-based Dermis Morphology Score）；在體評(píng)價(jià)皮膚老化，并定義了真皮老化指數(shù)SAAID（SHG-to-AF aging index of dermis）；化妝品成分作用機(jī)理的研究與探索，如膠原蛋白刺激類產(chǎn)品的功效驗(yàn)證等。

 

醫(yī)美功效評(píng)價(jià)應(yīng)用方向：激光美容功效評(píng)價(jià)、人體細(xì)胞活性檢測(cè)、人體皮膚膠原纖維可視化評(píng)估、人體皮膚彈性纖維可視化評(píng)估等。如評(píng)估點(diǎn)陣激光刺激彈性纖維和膠原纖維生成。

 

參考文獻(xiàn)

 

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