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1. 前言

 

膜蛋白可以分為外在膜蛋白與內(nèi)在膜蛋白，前者相對后者較容易提取，而后者幾乎只能通過使用去污劑分解膜增溶才能分離。本文從《蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)》中摘錄了三種從不同類型的樣本中分離膜蛋白的方法。

圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Fluid_mosaic_model

 

2. 細胞膜蛋白的分離方法

 

實驗步驟（此處為貼壁細胞）：

1. 收集待裂解細胞，冰上處理，去除上清（培養(yǎng)基），用pH 7.4 的 PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌單層細胞兩次。

 

2. 加人1 mL 2% Triton X - 114溶液，冰浴15 min。

 

3. 4℃下以10000 ×g離心5 ~10 min。

 

4. 37℃水浴10 min 以分離水相和去污劑相（有機相），然后在37℃下以2000 ×g離心10 min。

 

5. 收集水相留待后續(xù)分析。

 

6. 用500 μL冰冷的Buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2 min后升溫，按步驟3的操作再次進行離心。

 

7. 再次抽提去污劑相，隨后用Buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積。

 

8. 用等量的Buffer A分別稀釋水相與去污劑相，并進行免疫沉淀實驗驗證。

 

所用試劑配方：

● 2%Triton X - 114

 

 

成分	濃度
Triton X - 114	2% (w/v)
Tris - HCl (pH 7.5)	50 mmol/L
蛋白酶抑制劑	/

 

 

 

● Buffer A

 

 

成分	濃度
RIPA buffer	/
NaCl	0.5 mol/L

 

 

 

● Buffer C

 

 

成分	濃度
Tris HCl (pH7.5)	10 mmol/L
NaCl	150 mmol/L
EDTA (pH 7.5)	5 mmol/L

 

 

 

3. 組織膜蛋白的分離方法

 

實驗步驟：

1. 取待裂解組織，加入10 mL Buffer A于冰上充分勻漿。

 

2. 以800 rpm轉(zhuǎn)速在4 ℃ 下離心10 min后，將所得上清液轉(zhuǎn)移到超速離心管。

 

3. 以100000 ×g在4℃離心1 h。棄上清，將沉淀用適量的Buffer B重懸，在冰上孵育2 h后分裝至EP管，以10000 rpm轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心30 min。

 

4. 收集所得上清液即為膜組分。

 

所用試劑配方：

● Buffer A

 

 

成分	濃度
蔗糖	0.32 mol/L
Tris - HCl (pH 7.5)	5 mmol/L
KCl	120 mmol/L
EDTA	1 mmol/L
PMSF	0.2 mmol/L
Leupeptin	1 μg/mL
Pepstatin A	1 μg/mL
Aprotinin	1 μg/mL

 

 

 

*冰上預冷。

 

● Buffer B

 

 

成分	濃度
HEPES (pH 7.5)	20 mmol/L
甘油	10% (w/v)
Triton X-100	2% (w/v)
EDTA	1 mmol/L
PMSF	0.2 mmol/L
Leupeptin	1 μg/mL
Pepstatin A	1 μg/mL
Aprotinin	1 μg/mL

 

 

*冰上預冷。

 

4. 細菌膜蛋白的分離方法

 

實驗步驟：

1. 在37 ℃ 下過夜培養(yǎng)待裂解細菌，轉(zhuǎn)速設置為200 rpm。

 

2. 收集細菌細胞，在4℃下以10000 ×g轉(zhuǎn)速離心20 min，棄上清。

 

3. 用20 mL預冷的Tris - Mg緩沖液懸浮細菌細胞，按步驟2的條件再次離心，再次用預冷的Tris - Mg緩沖液重懸。

 

4. 超聲波破碎細菌細胞。

 

5. 以3000 ×g轉(zhuǎn)速在室溫下離心10 min，去除未破碎的細菌。小心吸取含有胞質(zhì)成分和細菌外被成分的上清液。

 

6. 第一次超速離心：100000 ×g，60 min，4 ℃，去除含胞質(zhì)成分的上清液，收集細菌外被成分。

 

7. 用10 mL SLS緩沖液重懸沉淀物，室溫孵育20 ~ 30 min。

 

8. 第二次超速離心：70000 ×g，60 min，在室溫沉淀，收集外膜蛋白，去除上清（含細胞質(zhì)膜）。重復步驟7&8。

 

9. 用移液器充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用0.1~0.2 mL的水重懸沉淀物。所得該蛋白質(zhì)樣品應在-70℃儲存。

 

所用試劑配方：

● Tris - Mg緩沖液

 

 

成分	濃度
Tris - HCl	10 mmol/L
MgCl2	5 mmol/L

 

 

*pH調(diào)節(jié)至 7.3，4℃保存。

● SLS緩沖液

 

 

成分	濃度
十二烷基肌氨酸鈉（SLS）	2% (w/v)
Tris - Mg 緩沖液	/

 

 

 

5. 參考文獻

 

[1] 張建社，褚武英，陳韜，2009，蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)，軍事醫(yī)學科學出版社