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光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)（ε）是不相等的，εL≠εR，這會(huì)使左、右圓偏振光透過后變成橢圓偏振光，這種現(xiàn)象稱為圓二色性（Circular dichroism，縮寫為 CD）。根據(jù)圓二色光譜法的原理和測試要求設(shè)計(jì)制成的儀器稱為圓二色光譜儀，該儀器廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象、酶動(dòng)力學(xué)、配位化合物、手性化合物等的科學(xué)研究。

 

利用圓二色光譜儀進(jìn)行分析時(shí)，所得結(jié)果常以圓二色光譜顯示。圓二色光譜中的橫坐標(biāo)是平面偏振光的波長 λ，縱坐標(biāo)為吸收系數(shù)之差（Δε=εL-εR）。由于 εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，摩爾橢圓度 [θ] 與 Δε 的關(guān)系為：[θ]=3300Δε，因此圓二色光譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖。

 

圓二色光譜儀的原理

 

光是橫電磁波，是一種在各個(gè)方向上振動(dòng)的射線。其電場矢量與磁場矢量相互垂直，且與光波傳播方向垂直。由于產(chǎn)生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動(dòng)矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動(dòng)面。若此振動(dòng)面不隨時(shí)間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動(dòng)面即稱為偏振面，如圖 1 所示。

 

圖 1 平面偏振光產(chǎn)生示意圖

 

平面偏振光可分解為振幅、頻率相同，旋轉(zhuǎn)方向相反的兩圓偏振光，如圖 2 所示，圓偏振光的振幅保持不變，而方向周期性變化，電場矢量繞傳播方向螺旋前進(jìn)。

 

圖 2 兩圓偏振光示意圖

 

其中電矢量以順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右旋圓偏振光，如圖 3 所示。其中以逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的稱為左旋圓偏振光，如圖 4 所示。兩束振幅、頻率相同，旋轉(zhuǎn)方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。如果兩束偏振光的振幅不相同，則合成的將是一束橢圓偏振光。

 

圖 3 右旋圓偏振光示意圖

 

圖 4 左旋圓偏振光示意圖

 

即能使射入物質(zhì)的平面偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)的物質(zhì)稱為旋光性物質(zhì)或光學(xué)活性物質(zhì)，具有手性結(jié)構(gòu)的分子才具有光學(xué)活性。

 

圓二色光譜儀的結(jié)構(gòu)

 

圓二色光譜儀主要由氙燈、單色器、光電調(diào)節(jié)器、樣品池以及光電倍增管檢測器組成，其結(jié)構(gòu)簡示圖如圖 5 所示。

圖 5 圓二色光譜儀的原理圖

 

該儀器采用氙燈作光源，光電倍增管作檢測器，波長范圍 165~850nm，檢測范圍為 ±3000m°，具有波長可調(diào)、光通量大、靈敏度高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確和信噪比高等優(yōu)勢。其中旋光色散附件包含一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的線偏振分析棱鏡，其以 45° 角處在樣品和檢測器之間來切換垂直和水平光。在圓二色光譜儀的光路上裝配旋光色散附件即可進(jìn)行旋光的測定，從而在手性藥物研究中不需使用兩種儀器。

 

圓二色光譜儀的圖譜

 

我們在引言部分提到了圓二色光譜儀的圖譜，即圓二色譜。由于吸收系數(shù)之差（Δε）有正值和負(fù)值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負(fù)性圓二色譜。在紫外可見光區(qū)域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機(jī)化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。

 

如圖 6 所示的圓二色譜，其中包含的三種曲線所代表的含義如下所示：

 

當(dāng)光學(xué)活性化合物對(duì)光沒有特征吸收時(shí)，在譜圖中僅為一條近似水平的直線；當(dāng)光學(xué)活性化合物對(duì)光存在特征吸收時(shí)，通常有兩種情況：（1）當(dāng) εL＞εR 時(shí)，得到一個(gè)正性的圓二色光譜曲線；（2）當(dāng) εL＜εR 時(shí)，得到一個(gè)負(fù)性的圓二色光譜曲線。

 

圖 6 圓二色光譜圖曲線

 

獲取理想的圖譜

 

在用圓二色光譜儀對(duì)溶液或固體樣品進(jìn)行測試時(shí)，我們都想獲取理想的 CD 譜圖，為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，我們應(yīng)該注意以下幾個(gè)方面：

 

手性樣品符合 CD 光譜測試的條件（在給定波長范圍內(nèi)有較強(qiáng)的CD信號(hào)和合適的吸收值）。必須事先測定手性樣品的 UV-Vis 吸收光譜（溶液或固體漫反射），預(yù)測 CD 譜峰的可能位置和選擇合適的制樣濃度（對(duì)于溶液吸收光譜，A≈1）。

 

提供高對(duì)映純度的手性樣品。

 

根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇測定方式（溶液、固體、單晶或熒光 CD）。

 

對(duì)溶液樣品應(yīng)選用合適的溶劑、濃度和光程（與測定 UV-Vis 光譜類似）。對(duì)于在紫外區(qū)測試的樣品建議選用較小的光程（≤0.5cm）和截止波長足夠低的溶劑，最好為高純水或醇類溶劑。

 

對(duì)固體樣品的壓片法測試，應(yīng)視樣品的不同選用合適百分比濃度及合適的稀釋劑（KBr、KCl 或 CsI 等）研磨壓片后進(jìn)行透射掃描。

 

選擇適當(dāng)?shù)臏y定參數(shù)（波長范圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等）。

 

對(duì)于同一個(gè)樣品，在可能的條件下，建議同時(shí)做其溶液和固體 CD 光譜加以比較。

 

最好同時(shí)做一對(duì)對(duì)映體的 CD 光譜，以檢查其 CD 信號(hào)的真?zhèn)魏驮诙康臈l件下互相印證其對(duì)映純度。

 

圓二色光譜儀的主要優(yōu)勢

 

圓二色光譜儀的主要技術(shù)性能優(yōu)勢如下：

 

1.光通量大，特別的光學(xué)設(shè)計(jì)，大大地提高了光通量、光強(qiáng)度，能在全波長范圍都可得到很好的信噪比，保證檢測數(shù)據(jù)的真實(shí)性。

 

2.靈敏度高，可以檢測更細(xì)微的結(jié)構(gòu)信息，如帶寬可以小至 0.1nm、0.01nm，從而能在檢測時(shí)得到精確、細(xì)微的指紋性結(jié)構(gòu)信息。

 

3.樣品（如有機(jī)合成物、蛋白樣品等）的用量少，可以用很微小的樣品池，如光程為 0.01mm（2.6μL）、0.1mm（26μL）的樣品池。

 

4.檢測器的位置可以調(diào)節(jié)，在分析脂質(zhì)體等高光散射類樣品時(shí)，得到特別大的光通量。

 

5.直接分析溫度相關(guān)的 CD 光譜信息，從而得到熱力學(xué)分析信息。

 

圓二色光譜儀的主要應(yīng)用

 

由于生物大分子基本都含有手性的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，而圓二色光譜儀可以幫助測量和觀察生物大分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，因此圓二色光譜技術(shù)成為生物物理和生物化學(xué)研究中的一個(gè)非常重要的手段，被廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)，生物化學(xué)，配位化學(xué)和藥物化學(xué)等領(lǐng)域，其主要應(yīng)用如下。

 

手性結(jié)構(gòu)測定：如官能團(tuán)的位置及特定原子在手性分子中的位置的測定。

 

構(gòu)型的測定：利用對(duì)應(yīng)關(guān)系和鄰近關(guān)系測定密切相關(guān)的一類化合物的相對(duì)構(gòu)型；利用八區(qū)律等一類經(jīng)驗(yàn)和半經(jīng)驗(yàn)的規(guī)律，結(jié)合其它方法測定絕對(duì)構(gòu)型。

 

手性介質(zhì)（包括溶劑和手性大分子）誘導(dǎo)的光學(xué)活性的研究，即一個(gè)非手性分子被外部介質(zhì)所誘導(dǎo)而產(chǎn)生光學(xué)活性。

 

溶劑效應(yīng)：研究溶劑與溶質(zhì)間的相互作用及該作用對(duì)分子的光學(xué)活性的影響。

 

圓二色光譜儀還可以用作光譜分析。

 

在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，蛋白質(zhì)溶液的圓二色譜可以反映蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息。蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵聯(lián)接而成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，其圓二色性表現(xiàn)為生色基團(tuán)和折疊結(jié)構(gòu)的總和。

 

張強(qiáng)等人在《中華鱉裙邊膠原蛋白的提取、鑒定及其理化性質(zhì)》一文中利用 Chirascan V100 型圓二色光譜儀對(duì)膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)中將凍干樣品溶于 0.05mol/L 的乙酸中，配制成 0.3mg/mL 的膠原蛋白溶液，取少量溶液加入 2mm 比色皿中，放入圓二色光譜儀中，于 25℃，190~250nm 的波長下掃描三次，記錄各光譜曲線，結(jié)果如圖 7 所示。

圖 7 裙邊酸溶性膠原 ASC 和酶浴性膠原 PSC 在 25℃ 時(shí)的圓二色光譜

 

由圖中可以看出，在 25 ℃ 下 ASC 和 PSC 的特征圓二色光譜分別在 224nm 和 222nm 處出現(xiàn)正峰，這是左旋聚脯氨酸構(gòu)型的圓二色譜典型特征，根據(jù)結(jié)果分析，PSC 的正/負(fù)吸收峰比值較 ASC 大，則說明 PSC 比 ASC 的三重螺旋結(jié)構(gòu)更完整。

 

圓二色光譜也常用于研究手性金納米粒子的微觀結(jié)構(gòu)和手性來源，韋克毅等人將手性金納米粒子的 CD 光譜信號(hào)的變化與 Ag+ 的濃度相關(guān)聯(lián)，這種方法既拓展了金納米粒子的應(yīng)用范圍，又對(duì) Ag+ 的識(shí)別與檢測提供了新的方法。

 

圖 8 和圖 9 分別為手性金納米粒子溶液中加入 10μmol/L Ag+ 后，在 0，0.5，1.0，3.0，4.0，6.0，7.5，10，11，14，15，20 和 25min 時(shí)的 CD 光譜以及在 230nm 處 CD 光譜強(qiáng)度的猝滅圖。

圖 8 手性金納米粒子溶液加入 Ag+ 后 CD 光譜圖

 

從圖中可以看出，手性金納米粒子的 CD 光譜強(qiáng)度隨著 Ag+ 的加入迅速下降，最終趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定時(shí)間為 12min，從響應(yīng)時(shí)間的角度考慮，該方法可以應(yīng)用于 Ag+ 的快速識(shí)別與檢測 。

 

圖 9 CD 光譜強(qiáng)度猝滅圖

 

從上述的兩個(gè)實(shí)例中不難看出，圓二色光譜儀對(duì)于研究分子結(jié)構(gòu)不對(duì)稱性、手性結(jié)構(gòu)測定等具有重要作用，在人們的生產(chǎn)生活中扮演著極其重要的角色。