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反義寡核苷酸（ASOs）被認(rèn)為是目前最先進(jìn)的RNA類(lèi)治療手段之一。ASOs是長(zhǎng)度為12–25個(gè)核苷酸的互補(bǔ)核酸片段，被設(shè)計(jì)為特異性地與內(nèi)源性前mRNA或mRNA的互補(bǔ)序列雜交，以調(diào)節(jié)生物功能。它們通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)：通過(guò)酶促裂解降解mRNA，改變前mRNA剪接以包含或排除特定內(nèi)含子/外顯子，或者改變調(diào)控RNA的功能。其他潛在的ASOs作用機(jī)制還包括通過(guò)阻礙核糖體活性誘導(dǎo)翻譯停滯、通過(guò)抑制剪接干擾前mRNA成熟、在細(xì)胞核內(nèi)使前mRNA不穩(wěn)定，或者糾正隱性剪接位點(diǎn)。ASOs的序列專(zhuān)門(mén)針對(duì)疾病病理學(xué)背后的遺傳異常。迄今為止，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)10種ASO藥物用于治療遺傳性疾病，例如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）、脊髓性肌萎縮癥（SMA）和家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病。

 

化學(xué)修飾的ASOs設(shè)計(jì)

 

Stephenson和Zamecnik首次將ASOs用于治療目的，并證明了基于DNA的ASOs可以在體外抑制病毒復(fù)制。然而，由于核酸酶對(duì)磷酸二酯骨架的降解以及蛋白質(zhì)結(jié)合能力差，導(dǎo)致其無(wú)法在體內(nèi)有效分布到組織中，這些發(fā)現(xiàn)未能在體內(nèi)得到持續(xù)驗(yàn)證。因此，大量的研究工作都集中在對(duì)ASO進(jìn)行化學(xué)修飾，以提高其穩(wěn)定性、組織靶向性、攝取能力、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。

 

對(duì)磷酸二酯骨架的修飾產(chǎn)生了新的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如磷酰胺、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基磷酸酯和磷酸酯類(lèi)似物，而核糖單元?jiǎng)t被修飾為2'-O-甲基、2'-氟或4'-硫代核糖，或者被替換為嗎啉環(huán)。此外，還評(píng)估了用非天然或修飾的堿基（如次黃嘌呤、7-去氮鳥(niǎo)嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代尿嘧啶和二氟甲苯）替換DNA/RNA核苷酸堿基，以提高代謝穩(wěn)定性和增強(qiáng)雜交親和力。目前具有臨床應(yīng)用價(jià)值的兩大ASO平臺(tái)是磷酰胺嗎啉寡核苷酸（PMOs）和硫代磷酸酯（PSs）。

 

ASOs ADME特征

 

吸收和分布

 

ASO藥物的吸收取決于其不同的理化特性，包括離子化、酸解離常數(shù)（pKa）、疏水性以及給藥途徑。藥物的分布則取決于給藥途徑、游離藥物濃度、組織血流灌注、組織結(jié)合、局部pH以及細(xì)胞膜的通透性。

 

第一代和第二代PS修飾寡核苷酸由于其骨架帶負(fù)電荷，能夠與血漿蛋白（特別是白蛋白）高度結(jié)合（結(jié)合率> 85%）。例如，Mipomersen在人體和小鼠中的蛋白結(jié)合率分別為95%、85%。而基于PMO修飾的ASOs是不帶電的，在人體中的蛋白結(jié)合率較低（6%-17%），從而限制了其組織吸收。例如，PMO類(lèi)藥物Eteplirsen人血漿蛋白結(jié)合率為6.1%-16.5%。由于血漿蛋白結(jié)合與細(xì)胞攝取和腎小球?yàn)V過(guò)相關(guān)，PS-ASOs與PMOs相比具有更持久的組織分布和更慢的尿液排泄特性，這可以通過(guò)它們的蛋白結(jié)合差異來(lái)解釋。

 

口服給藥的PS-ASOs和PMOs由于分子量較大且親水性強(qiáng)，導(dǎo)致其膜通透性低，吸收效果差。雖然口服給藥不可行，但通過(guò)化學(xué)修飾可以實(shí)現(xiàn)靜脈或皮下注射后的系統(tǒng)暴露。目前，大多數(shù)ASOs通過(guò)靜脈注射給藥，以確保生物利用度最高。這種給藥方式使得藥物能夠快速分布至血管化程度高的器官（如肝臟、腎臟和脾臟）。不過(guò)，ASOs分布到心臟、肌肉和肺等組織的速度較慢，因此需要更頻繁的給藥。比如，臨床試驗(yàn)中，每周一次靜脈注射Eteplirsen（30 mg/kg），其平均表觀分布容積（Vd）為601 ml/kg，提示組織中的分布較高。單次或多次靜脈注射后的Cmax通常出現(xiàn)在注射結(jié)束時(shí)，且多次給藥PK呈劑量比例關(guān)系。

 

另外，由于寡核苷酸藥物不具有膜通透性，它們通過(guò)吞噬作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而不是被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞攝取過(guò)程大致可以分為兩個(gè)步驟：ASOs吸附到細(xì)胞表面蛋白和內(nèi)化。許多細(xì)胞表面受體參與ASOs的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用，包括表皮生長(zhǎng)因子受體、G蛋白偶聯(lián)受體和清道夫受體。特別是關(guān)于清道夫受體的研究有很多，發(fā)現(xiàn)它們介導(dǎo)裸ASOs的攝取，例如stabilin-1和stabilin-2介導(dǎo)PS-ASOs的肝臟攝取，清道夫受體A1介導(dǎo)PMOs的肌肉攝取。內(nèi)化的ASOs需要從內(nèi)體中釋放出來(lái)，才能與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的目標(biāo)RNA相互作用。這些細(xì)胞內(nèi)ASO的運(yùn)輸過(guò)程被認(rèn)為受到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)域中多種蛋白的相互作用調(diào)控。通過(guò)使用生物素標(biāo)記的PS-ASOs進(jìn)行親和力選擇，Liang等人鑒定了一組與PS-ASOs相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白。最近的一項(xiàng)研究表明，在早期內(nèi)體途徑中，Rab5C和早期內(nèi)體抗原1（EEA1）參與了PS-ASOs的運(yùn)輸，并在stabilin介導(dǎo)的內(nèi)化后促進(jìn)它們的內(nèi)體逃逸；在晚期內(nèi)體途徑中，Rab7A和溶酶體雙磷酸甘油磷脂參與了PS-ASOs的運(yùn)輸。與PS-ASOs相比，關(guān)于PMOs細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制的分子基礎(chǔ)研究較少。

 

為了進(jìn)一步優(yōu)化ASOs的組織分布情況，目前正在研究將ASOs與脂肪酸或肽結(jié)合。比如（GalNAc3）ASO結(jié)合物已經(jīng)進(jìn)入臨床階段，本品通過(guò)唾液酸糖蛋白受體被肝細(xì)胞主動(dòng)攝取，顯著增強(qiáng)了對(duì)肝細(xì)胞的靶向遞送，從而改善了藥效。

 

另一種成功提高ASOs穿透能力的方法是通過(guò)與細(xì)胞穿透肽（CPPs）結(jié)合。肽的正電荷有助于與不帶電的PMO ASO結(jié)合。研究表明，CPPs通過(guò)內(nèi)吞機(jī)制促進(jìn)PMO進(jìn)入細(xì)胞，該機(jī)制涉及CPP的陽(yáng)離子與細(xì)胞表面蛋白多糖的陰離子之間的相互作用。CPPs已被用于提高PMOs在肌肉組織中的細(xì)胞攝取。

 

另外，如前文所述，給藥途徑對(duì)ASO產(chǎn)品的分布有影響。與IV相比，SC給藥后的ASO分布半衰期通常更長(zhǎng)，可能是由于藥物從注射部位逐漸吸收所致。一項(xiàng)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中進(jìn)行的研究顯示，通過(guò)IV或SC給予320 mg/kg的Eteplirsen，顯示SC給藥后的生物利用度為100%，并且Cmax出現(xiàn)在大約藥后7小時(shí)。Mipomersen在猴子中也顯示出可以從皮下注射部位完全吸收，生物利用度為100%，Cmax出現(xiàn)在3-4小時(shí)。

 

當(dāng)然，對(duì)于IV或SC給藥無(wú)法到達(dá)的靶部位，直接局部ASO給藥也是可行的。局部給藥可用于眼部、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等系統(tǒng)給藥難以到達(dá)的靶組織。以Fomivirsen為例，通過(guò)玻璃體注射將藥物局部遞送至眼睛，只需要少量藥物，并且可以直接分布到視網(wǎng)膜。鞘內(nèi)給藥可以繞過(guò)血腦屏障，使ASO能夠遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。盡管具有一定的侵入性，但鞘內(nèi)給藥已被證明在增加ASO在大腦和脊髓中的生物利用度方面是有效的，并且與IV和SC相比，減少了全身暴露。Nusinersen的鞘內(nèi)給藥展示了ASOs在CNS領(lǐng)域應(yīng)用的潛力，并為靶向新的適應(yīng)癥（如亨廷頓病和肌萎縮側(cè)索硬化癥）打開(kāi)了大門(mén)。成年食蟹猴中進(jìn)行的單次鞘內(nèi)注射結(jié)果顯示，藥物在脊髓中廣泛分布，并達(dá)到具有藥理活性的水平。此外，給藥后7天的組織分析結(jié)果顯示，nusinersen在CNS組織中的總量呈劑量依賴性，且在脊髓和皮層中的分布更多。即使在最低劑量（1 mg/kg）時(shí)，目標(biāo)組織中的藥物水平也比EC50（~1μg/g）高出3-8倍。

 

鼻內(nèi)給藥正在探索作為ASO用于CNS適應(yīng)癥的給藥方式之一。鼻內(nèi)給藥后，ASO分子可以通過(guò)嗅神經(jīng)和三叉神經(jīng)通路等進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。使用CPP可以進(jìn)一步增強(qiáng)CNS的遞送，且已經(jīng)在siRNA中取得成功。

 

因胃腸道吸收有限，口服給藥對(duì)ASOs是一種挑戰(zhàn)。PS類(lèi)ASO ISIS 14725在大鼠中通過(guò)十二指腸給藥后的生物利用度約為5.5%，而PMO類(lèi)AVI-4472的口服生物利用度在大鼠中為41%-79%。然而，尚未見(jiàn)PMOs在人類(lèi)中的口服給藥情況的報(bào)道。

 

代謝

 

雖然ASOs主要被核酸酶代謝，但其代謝穩(wěn)定性因不同的平臺(tái)和種屬而有所差異，主要取決于其化學(xué)骨架（如下表所示）。

 

 

 

核酸酶分為外切酶和內(nèi)切酶，外切酶主要切割A(yù)SO的末端位點(diǎn)，識(shí)別3′-羥基。內(nèi)切酶則切割A(yù)SO的內(nèi)部部分，識(shí)別核糖上的2′-羥基。缺乏3′和5′末端核糖修飾的ASOs主要被外切酶降解，生成3′或5′縮短的片段，這些片段可能仍具有反義活性，但也會(huì)被組織中的內(nèi)切酶進(jìn)一步降解。

 

Defibrotide是一種具有天然磷酸二酯骨架的ASO混合物，它被血漿外切酶和多種DNA降解酶迅速代謝，釋放出游離的2′-脫氧核糖、嘌呤和嘧啶堿基。因此，Defibrotide在2小時(shí)靜脈輸注后的半衰期僅為14分鐘。

 

再看下PS修飾ASOs的代謝。Mipomersen和Nusinersen是第二代PS修飾ASOs，其代謝主要發(fā)生在硫代磷酸酯骨架上，通過(guò)核酸酶的作用。Mipomersen代謝由內(nèi)切酶和外切酶介導(dǎo)，形成不再具有藥理活性的短序列代謝產(chǎn)物。Nusinersen通過(guò)鞘內(nèi)給藥遞送至大腦后，其代謝由外切酶3′和5′介導(dǎo)的水解作用完成，切割末端核苷酸，產(chǎn)生縮短的ASO代謝產(chǎn)物。由于大腦的代謝活性較低，nusinersen在給藥后1年仍可在大腦中被檢測(cè)到，反映了其在腦脊液中的長(zhǎng)半衰期（135-177天）。Fomivirsen是通過(guò)玻璃體注射給藥的PS修飾ASO。Fomivirsen在人體中的清除速度較慢，半衰期約為55小時(shí)。臨床前研究表明，分布到視網(wǎng)膜的Fomivirsen通過(guò)外切酶消化緩慢代謝。另外，對(duì)于PS-ASOs，已觀察到小鼠、猴子、大鼠和人類(lèi)的代謝途徑相似，表明PS-ASOs的代謝途徑在種屬間沒(méi)有顯著差異，且PS-ASO代謝物的系統(tǒng)暴露量通常較低。

 

PMOs修飾的ASOs通常在核酸酶下非常穩(wěn)定。如Eteplirsen與血漿和肝細(xì)胞組分共孵育時(shí)，未形成任何代謝產(chǎn)物。然而，對(duì)于PPMOs（肽偶聯(lián)PMO），其CPP序列可能會(huì)引入一個(gè)代謝位點(diǎn)，容易被廣泛存在的蛋白酶降解。

 

其他偶聯(lián)ASOs的代謝情況。例如，3H-ION-681257是一種基于PS的ASO，與GalNAc3偶聯(lián)，給予大鼠后觀察到大量肝臟分布，主要代謝途徑是氧化，形成14個(gè)與GalNAc3相關(guān)的連接子代謝產(chǎn)物和游離ASO。膽汁排泄的代謝產(chǎn)物與腎臟排泄的代謝產(chǎn)物相同，除了氧化的線性和環(huán)狀連接子代謝產(chǎn)物。3H-ION-681257被N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、脫氧核糖核酸酶II、堿性磷酸酶和醇/醛脫氫酶代謝。

 

ASOs不是CYP450酶的底物，尚未報(bào)告任何已批準(zhǔn)的ASOs存在CYP介導(dǎo)的代謝產(chǎn)物。此外，由于它們對(duì)CYP酶的親和力低，ASOs尚未顯示出與其他小分子藥物存在藥物相互作用（DDIs）。幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)旨在評(píng)估ASOs與華法林（CYP2C9/3A4）、辛伐他?。–YP3A4）、依折麥布（多種尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶）、羅格列酮（CYP2C8/2C9）、格列吡嗪（CYP2C8/2C9）、二甲雙胍（腎臟）、順鉑（腎臟）和吉西他濱（核苷激酶）的潛在藥物相互作用，結(jié)果顯示不存在藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)。最近一項(xiàng)研究考察了ISIS 304801、ISIS 420915、ISIS 681257和ISIS 396442，結(jié)果表明這些受試ASOs均未顯示出對(duì)CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1或CYP3A4的潛在抑制作用。此外，在凍存的人類(lèi)原代肝細(xì)胞中，這些受試化合物在酶活性水平或mRNA水平上均未顯示出對(duì)CYP1A2、CYP2B6或CYP3A4的誘導(dǎo)作用。這些數(shù)據(jù)與之前報(bào)道的ASOs與CYP酶之間無(wú)相互作用的結(jié)果一致。

 

排泄

 

ASOs主要以原型藥通過(guò)尿液或糞便排泄。然而，尿液或糞便中排泄的程度取決于ASOs的化學(xué)性質(zhì)、給藥途徑、動(dòng)物種屬和偶聯(lián)情況。蛋白質(zhì)結(jié)合的程度也會(huì)影響排泄，因?yàn)榕c血漿蛋白的結(jié)合使ASOs免于腎小球?yàn)V過(guò)，從而減緩腎臟清除（ASOs清除的主要途徑）。PMO修飾ASOs的高腎臟清除率可能與低蛋白結(jié)合率相關(guān)，導(dǎo)致其較短的血漿半衰期。

 

在腎功能正常的健康志愿者中，大約有10%-14%的Defibrotide以原型形式通過(guò)尿液排泄，19%通過(guò)糞便排泄。然而，在腎功能受損的患者中，AUC增加了50%-60%。腎功能受損的患者需要特別監(jiān)測(cè)，并進(jìn)行必要的劑量調(diào)整。

 

蛋白質(zhì)結(jié)合在排泄中的作用也體現(xiàn)在mipomersen上，這是一種第二代PS修飾的ASO。帶負(fù)電荷的2′修飾PS與白蛋白結(jié)合，使其免于通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)被清除。小鼠25 mg/kg皮下注射后，24小時(shí)內(nèi)有23%的mipomersen通過(guò)尿液排泄，而5 mg/kg皮下注射后這一比例僅為1%。Mipomersen在小鼠體內(nèi)的清除率高于人類(lèi)，小鼠的血漿清除率為674 ml/h/kg，半衰期為0.33小時(shí)，而人血漿清除率為40.9 ml/h/kg，半衰期為1.26小時(shí)，可能與小鼠的蛋白結(jié)合率較低有關(guān)。

 

3H-ION-681257是一種第二代PS ASO，與THA-C6-triantennary GalNAc3偶聯(lián)，通過(guò)唾液酸糖蛋白受體實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的靶向遞送。由于在肝臟中的特異性分布，3H-ION-681257被迅速代謝并排泄，在給藥后48小時(shí)內(nèi)，尿液和糞便中分別回收了26%和71%的放射性。盡管腎臟清除是大多數(shù)ASOs的主要排泄途徑，但nusinersen（第二代PS ASO）的腎臟排泄并不明顯。在第三次給藥后的第85天，尿液中檢測(cè)到約0.5%的原型藥物；不過(guò)，由于未追蹤其代謝產(chǎn)物，不能排除腎臟是主要排泄途徑的可能性。這種低腎臟排泄很可能是因?yàn)槠湓诮M織中的長(zhǎng)半衰期（在猴子的脊髓和大腦中超過(guò)100天）以及從中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織到全身循環(huán)的緩慢清除過(guò)程。

 

臨床試驗(yàn)表明，Eteplirsen PMO主要以原型藥形式通過(guò)尿液排泄，經(jīng)50 mg/kg靜脈輸注后，69.4%被排泄。Eteplirsen在50 mg/kg靜脈輸注后的總清除率為5.3 ml/min/kg，腎臟清除率在相同劑量下為3.9 ml/min/kg，占總系統(tǒng)清除率的三分之二。

 

AVI-6002和AVI-6003是以前分別用于埃博拉病毒和馬爾堡病毒暴露后預(yù)防的聯(lián)合療法。AVI-6002由AVI-7537和AVI-7539組成，AVI-6003由AVI-7287和AVI-7288組成。這四種成分都屬于PMOplus平臺(tái)，該平臺(tái)在骨架上含有特定位置的正分子電荷。在臨床試驗(yàn)中，當(dāng)這四種成分被給予健康志愿者時(shí)，PMOplus藥物都在給藥后的前24小時(shí)內(nèi)通過(guò)尿液排泄。這四種藥物觀察到了劑量依賴性的腎臟清除：AVI-7537、AVI-7539、AVI-7287、AVI-7288分別有44%、31%、39%、52%以原型藥形式被排泄。

 

文章最后，簡(jiǎn)單總結(jié)下ASOs與傳統(tǒng)小分子的DMPK異同，如下表所示。