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近期，國家食源性疾病監(jiān)測系統(tǒng)陸續(xù)接報多起由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件，通過歸因分析，特作以下風(fēng)險提示：

 

1.什么是產(chǎn)氣莢膜梭菌？

 

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌，廣泛分布于污水、土壤等環(huán)境及人和動物腸道中。產(chǎn)氣莢膜梭菌既有“莢膜”護體，又可產(chǎn)生“芽胞”休眠，可以抵抗高溫、冷凍、高壓等各種環(huán)境不利條件，待到適宜的生存條件時，便可結(jié)束休眠狀態(tài)，繁殖產(chǎn)毒。

 

2.產(chǎn)氣莢膜梭菌的危害是什么？

 

產(chǎn)氣莢膜梭菌具有異常迅速的生長繁殖能力，可分泌多種毒素，不同毒素可引起特定的疾病和癥狀，臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腹部痙攣性疼痛、脹氣，每日腹瀉次數(shù)可高達十余次，水樣便或稀便，伴腐敗性惡臭，嘔吐、惡心、頭痛癥狀較少見，一般不發(fā)熱。重癥者有虛脫、痙攣、意識障礙及腸出血、壞死等癥狀。潛伏期一般為2~36小時，癥狀多于48小時后緩解，除老幼體弱者外往往預(yù)后良好。

 

3.高危食品和危險因素有哪些？

 

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種食源性人畜共患病致病菌，可通過污染雞、鴨、豬、牛、羊等動物性食品經(jīng)食物鏈傳播給人，夏、秋季節(jié)高發(fā)。我國高危食品以集體供應(yīng)的批量烹飪?nèi)忸愂称窞橹鳎u、鴨和肉醬（汁）等，高危因素主要為烹飪不徹底、緩慢冷卻、生熟交叉污染。

 

4.如何預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌污染？

 

預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的關(guān)鍵是“充分加熱、快速冷卻、避免污染”。肉類等高風(fēng)險食品需徹底煮熟，確保中心溫度≥70℃，并持續(xù)1分鐘以上；在室溫下存放不得超過2小時，應(yīng)及時低溫冷藏，大量烹飪的食品應(yīng)分裝為小份，快速降至4℃以下，再食用時應(yīng)徹底加熱；避免生食與熟食交叉污染，廚具應(yīng)洗凈消毒后使用，注重廚房衛(wèi)生。

 

GB 4789.13-2012 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗

 

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)特性

 

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringen）是一種廣泛存在于自然界的厭氧革蘭氏陽性桿菌，常見于土壤、污水及食品基質(zhì)中。該菌還是人和其他動物胃腸道微生物群的組成部分，屬于條件性致病菌。在臨床上，該菌不僅與人類及動物的氣性壞疽發(fā)生密切相關(guān)，還可引發(fā)食物中毒、非食源性腹瀉、壞死性腸炎以及腸毒血癥等多種消化道疾病。研究發(fā)現(xiàn)該菌的致病性主要依賴于其產(chǎn)生的外毒素和酶，并根據(jù)其產(chǎn)生的外毒素類型可將其分為A、B、C、D、E、F和G七種類型。

 

2、GB4789.13-2012 產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗

 

2.1 培養(yǎng)基和試劑

 

胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂

 

液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）

 

緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基

 

乳糖-明膠培養(yǎng)基

 

含鐵牛乳培養(yǎng)基

 

0.1%蛋白胨水

 

革蘭氏染色液

 

硝酸鹽還原試劑

 

緩沖甘油-氯化鈉溶液

 

2.2 檢驗程序

 

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗程序

 

2.3 樣品制備

 

2.3.1 樣品采集后應(yīng)盡快檢驗，若不能及時檢驗，可在2℃～5℃保存；如8h內(nèi)不能進行檢驗，應(yīng)以無菌操作稱取25g（mL）樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料），并盡快至于-60℃低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。

 

2.3.2 以無菌操作稱取25g（mL）樣品放入含有225mL0.1%蛋白胨水（如為2.3.1中冷凍保存樣品，室溫解凍后，加入200mL0.1%蛋白胨水）的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min～2min；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，作為1:10稀釋液。

 

2.3.3 以上述1:10稀釋液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制備10-2～10-6的系列稀釋液。

 

2.4 培養(yǎng)

 

2.4.1 吸取各稀釋液1mL加入無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至50℃的TSC瓊脂（可放置于50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）15mL，緩慢旋轉(zhuǎn)平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。

 

2.4.2 上述瓊脂平板凝固后，再加10mL冷卻至50℃的TSC瓊脂（可放置于50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）均勻覆蓋平板表層。

 

2.4.3 待瓊脂凝固后，正置于厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)20h～24h。

 

2.5 TSC瓊脂培養(yǎng)基及產(chǎn)氣莢膜梭菌典型菌落特征

 

胰胨、大豆胨和酵母粉提供細菌生長所需的碳源、氮源、維生素等營養(yǎng)元素；焦亞硫酸鈉和檸檬酸鐵銨用于檢測硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色；D-環(huán)絲氨酸抑制非梭菌的細菌；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

 

典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC瓊脂平板上為黑色菌落。使用君立康動態(tài)菌落計數(shù)儀對TSC瓊脂平板上培養(yǎng)結(jié)束的產(chǎn)氣莢膜梭菌進行拍照及計數(shù)，可實現(xiàn)抗筆記干擾的精準(zhǔn)計數(shù)和對檢驗結(jié)果的數(shù)據(jù)留存。

 

2.6 確證實驗

 

2.6.1 從單個平板上任選5個（小于5個全選）黑色菌落，分別接種到FTG培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

 

2.6.2 用上述培養(yǎng)液涂片，革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌，有時可見芽孢體。如果培養(yǎng)液不純，應(yīng)劃線接種TSC瓊脂平板進行分純，36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)20h～24h，挑取單個典型黑色菌落接種到FTG培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，用于后續(xù)的確證試驗。

 

2.6.3 取生長旺盛的FTG培養(yǎng)液1mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46℃±0.5℃水浴中培養(yǎng)2h后，每小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，該現(xiàn)象的特點是乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì)，通常會上升到培養(yǎng)基表面。5h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。

 

2.6.4 用接種環(huán)（針）取FTG培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基，于36℃±1℃培養(yǎng)24h。在透射光下檢查細菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長，無動力的菌株只沿穿刺線生長。然后滴加0.5mL試劑甲和0.2mL試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15min內(nèi)出現(xiàn)紅色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許鋅粉，放置10min，出現(xiàn)紅色者，表明該菌株不能還原硝酸鹽。產(chǎn)氣莢膜梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。

 

2.6.5 用接種環(huán)（針）取FTG培養(yǎng)液穿刺接種乳糖-明膠培養(yǎng)基，于36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃，表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。將試管于5℃左右放置1h，檢查明膠液化情況。如果培養(yǎng)基是固態(tài)，于36℃±1℃再培養(yǎng)24h，重復(fù)檢查明膠是否液化。產(chǎn)氣莢膜梭菌能發(fā)酵乳糖，使明膠液化。

 

2.7 結(jié)果與報告

 

2.7.1 典型菌落計數(shù)

 

選取典型菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果：

 

a) 只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

 

b）最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)均小于20CFU，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

 

c）某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于200CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

 

d）某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于200CFU，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落數(shù)不在20CFU～200CFU之間，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

 

e）2個連續(xù)稀釋度平板的典型菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間，分別計數(shù)2個稀釋度平板上的典型菌落。

 

2.7.2 結(jié)果計算

 

計數(shù)結(jié)果按下列公式計算：

 

式中：

 

T——樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；

 

A——單個平板上典型菌落數(shù)；

 

B——單個平板上經(jīng)確證試驗為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；

 

C——單個平板上用于確證試驗的菌落數(shù)；

 

n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個數(shù)；

 

n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個數(shù)；

 

0.1——稀釋系數(shù)；

 

d——稀釋因子（第一稀釋度）。

 

2.7.3 報告

 

根據(jù)TSC瓊脂平板上產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型菌落數(shù)，按照2.7.2中公式計算，報告每g（mL）樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)，報告單位以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。

 

文章來源：國家食品安全風(fēng)險評估中心、GB 4789.13-2012