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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-05-12 20:29
摘 要：建立液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定尿液中烏頭堿和新烏頭堿的含量。向尿液樣品中加入一定量的萃取溶劑，渦旋，離心，取上層有機相，重復(fù)萃取兩次，合并萃取液，氮吹至干，再復(fù)溶于乙腈中。以乙腈和含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相，梯度洗脫，采用Acquity BEH C18色譜柱分離，電噴霧離子源正離子方式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式監(jiān)測，以保留時間和特征離子定性，外標(biāo)法定量。烏頭堿和新烏頭堿的質(zhì)量濃度在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.998，方法檢出限為0.01 μg/L。樣品加標(biāo)平均回收率為99.2%～105.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～4.1%（n=5）。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，適用于食物中毒患者尿液中烏頭堿和新烏頭堿的檢測。
關(guān)鍵詞：烏頭堿；新烏頭堿；液液萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；尿液
烏頭屬毛莨科植物，主要包括川烏和草烏，具有鎮(zhèn)痛、強心、抗炎、祛風(fēng)散寒等藥理作用。其有效成分主要為劇毒的雙酯型生物堿，主要包括烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿。烏頭堿和新烏頭堿對心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等具有強毒性，中毒癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、嘔吐、口舌麻木等，每年由于誤飲含烏頭堿藥酒引起的中毒案例屢見不鮮[1]。烏頭堿和新烏頭堿小鼠灌胃半數(shù)致死量分別為1.8、1.9 mg/kg，成人口服烏頭堿0.2 mg就可引起中毒，2～5 mg可致死，從染毒至死亡只需8 min～4 ｈ[2]。烏頭堿和新烏頭堿中毒通常是急性的，對疑似中毒患者生物樣本中烏頭堿和新烏頭堿的準(zhǔn)確檢測是診斷食物中毒的前提和必要條件，有助于烏頭堿和新烏頭堿中毒患者獲得精準(zhǔn)及時的救治，提高患者的生存概率。
烏頭堿常見的檢測方法主要有薄層掃描法[3]、ELISA法[4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、高效液相色譜法[
1.實驗部分
1.1主要儀器與試劑
超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：QTrap 6500+型，美國愛博才思分析儀器有限公司。
超純水機：Milli-Q型，美國密理博公司。
高速離心機： Sigma 2-16型，德國西格瑪公司。
全自動樣品氮吹濃縮儀：廣州得泰儀器科技有限公司。
移液槍：ZY26618型，德國艾本德公司。
烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，編號1ST40034-100 A，批號為S075209，天津阿爾塔科技有限公司。
新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，編號為1ST000392-100 A，批號為S079835，天津阿爾塔科技有限公司。
乙腈、甲醇：均為質(zhì)譜級，德國默克公司。
正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯：均為色譜級，德國默克公司。
甲基叔丁基醚：質(zhì)譜級，上海羅恩試劑公司。
甲酸：質(zhì)譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司。
實驗用水為超純水，由Milli-Q凈化系統(tǒng)制備。
1.2儀器工作條件
1.2.1色譜儀
色譜柱：Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：45 ℃；流量：0.3 mL/min；進樣體積：1.0 μL；流動相：A相為含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨溶液，B相為乙腈；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1梯度洗脫程序Tab. 1Gradient eluation program
1.2.2質(zhì)譜儀
離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；離子源溫度：300 ℃；離子噴霧電壓：5 500 V；碰撞氣壓力：“High”；氣簾氣壓力：276 kPa；噴霧氣壓力：483 kPa；輔助加熱氣壓力：483 kPa。烏頭堿和新烏頭堿的質(zhì)譜參數(shù)見表2。
表2烏頭堿和新烏頭堿質(zhì)譜參數(shù)Tab. 2Mass spectrum parameters of aconitine and mesaconitine
注：帶*號的為定量離子。
1.3溶液配制
烏頭堿、新烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。
烏頭堿、新烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：取烏頭堿、新烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。
烏頭堿、新烏頭堿系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取烏頭堿、新烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液100 µL，用乙腈定容至1.0 mL，配制成質(zhì)量濃度均為100 µg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、50、100、400、1 000 µL，用乙腈定容至1.0 mL，配制成烏頭堿、新烏頭堿的質(zhì)量濃度均分別為1、5、10、40、100 µg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.4樣品處理
將尿液樣品從-80 ℃超低溫冰箱取出，于室溫下解凍，混合均勻后，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，除去尿液樣品中顆粒物雜質(zhì)。準(zhǔn)確吸取2.0 mL尿液樣品于15 mL離心管中，加入3.0 mL乙酸乙酯，以2 500 r/min轉(zhuǎn)速振蕩5 min，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速振蕩(離心半徑10 cm)離心5 min，吸取上層乙酸乙酯層于另一15 mL離心管中，向下層尿樣溶液中加入3.0 mL乙酸乙酯重復(fù)上述步驟，合并萃取液，于30 ℃、34.5 kPa氮氣壓力下吹干，加入200 μL乙腈復(fù)溶，渦旋，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為樣品溶液。
1.5測定方法
取烏頭堿、新烏頭堿系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2儀器工作條件下進行測定，以烏頭堿和新烏頭堿的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用保留時間和特征離子定性，用外標(biāo)法定量。
2.結(jié)果與討論
2.1萃取溶劑選擇
萃取溶劑的選擇會直接影響尿樣中烏頭堿和新烏頭堿的萃取效果，分別考察二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷4種常見萃取溶劑對尿液樣品中烏頭堿和新烏頭堿的萃取效果，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，以正己烷為萃取溶劑時，烏頭堿和新烏頭堿的萃取效果極差，回收率基本為0；以乙酸乙酯和甲基叔丁基醚為萃取溶劑時，烏頭堿和新烏頭堿均具有較高的回收率，由于乙酸乙酯的LD50值(半數(shù)致死量)大于甲基叔丁基醚的LD50值，因此選擇毒性較低的乙酸乙酯為萃取溶劑。
圖1不同萃取溶劑時的回收率Fig. 1Recoveries of different extraction solvents
2.2烏頭堿和新烏頭堿總離子流圖
按照1.3方法處理樣品，以乙酸乙酯作為萃取溶劑，在1.2儀器工作條件下測得的烏頭堿和新烏頭堿的MRM總離子流色譜圖如圖2所示。
圖2烏頭堿和新烏頭堿的MRM總離子流色譜圖Fig. 2MRM total ion chromatogram of aconitine and mesaconitine
2.3線性方程、檢出限和定量限
在1.2儀器工作條件下，測定烏頭堿、新烏頭堿系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。將質(zhì)量濃度為0.1 μg/L的加標(biāo)樣品溶液用乙腈逐級稀釋，按照1.2儀器工作條件測定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限和定量限。烏頭堿和新烏頭堿的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表3。由表3可知，烏頭堿和新烏頭堿的質(zhì)量濃度在1.0～100.0 µg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系。
表3質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Tab. 3Linear range of mass concentration，linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantification limits
2.4加標(biāo)回收與精密度試驗
以健康人尿液為空白樣品，分別添加不同體積的烏頭堿、新烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、5.0 μg/L的加標(biāo)樣品，每個濃度水平平行制備5份，按1.3方法處理后測定，分別計算烏頭堿和新烏頭堿各個濃度水平的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。由表4可知，樣品加標(biāo)平均回收率為99.2%～105.4%，RSD為1.7%～4.1%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。
表4樣品加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果
Tab. 4Results of sample spiked recovery and precision test
3.結(jié)語
基于液液萃取的樣品處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜建立了尿液樣品中烏頭堿和新烏頭堿的定量分析方法，并對萃取溶劑進行了優(yōu)化，選擇乙酸乙酯為萃取溶劑。該方法的建立為尿液樣品中烏頭堿和新烏頭堿的準(zhǔn)確檢測提供了新方法，為烏頭堿中毒患者的早期診斷及后期愈合評估提供新的依據(jù)。
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引用本文：鄧芬芳，白志軍，譚志科，等 . 液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定尿液中烏頭堿和新烏頭堿［J］. 化學(xué)分析計量，2025，34（1）： 88.(DENG Fenfang, BAI Zhijun, TAN Zhike, et al. Simultaneous determination of aconitine and mesaconitine in urine by liquid-liquid extraction combined with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 88.)
來源：化學(xué)分析計量
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