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1. 前言

 

本文節(jié)選自Humana Press于2020年出版的書籍《Experimental Protocols in Biotechnology》，屬于Springer Protocols系列， ISBN 978-1-0716-0606-3。

 

文章編譯的是其中的第一篇論文《Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Detection of Bacterial Wilt–Causing Ralstonia solanacearum》。

 

在翻譯的過程中依據(jù)國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣人工增加了備注。原文介紹的是使用雙抗夾心ELISA對(duì)植物樣本中的茄科羅爾斯通氏菌進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。

 

2. 結(jié)果有效性驗(yàn)證

 

1. 定性分析

在孵育約20 min后，觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)。陰性和空白對(duì)照組肉眼看來應(yīng)該基本上是清澈的。顯色的濃淡程度可用于大致估測(cè)微生物載量。在沒有分光光度計(jì)的情況下，這種定性數(shù)據(jù)也可用于診斷植物病原體的存在?？偠灾褪怯兴{(lán)色就是陽性有菌。

 

2. 定量分析

使用酶標(biāo)儀在600 nm波長下測(cè)量所有孔的OD值（光密度）。出現(xiàn)藍(lán)色的孔呈陽性結(jié)果。加入硫酸作為終止液后，再使用450 nm波長測(cè)量觀察到的黃色顯色。沒有顯著顏色變化的孔表示陰性結(jié)果。只有當(dāng)陽性對(duì)照孔顯示陽性結(jié)果，且緩沖液或陰性對(duì)照孔保持無色時(shí)，測(cè)試結(jié)果才有效。

 

3. ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成與擬合

 

1. 收集標(biāo)準(zhǔn)品R. solanacearum F1C1不同細(xì)胞濃度對(duì)應(yīng)的吸光度數(shù)據(jù)，用以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將已知抗原/細(xì)菌樣品的數(shù)量設(shè)為x軸，三組重復(fù)的吸光度平均值設(shè)為y軸。

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)保證定量實(shí)驗(yàn)中不同實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，并且每塊微孔板都應(yīng)該單獨(dú)重復(fù)一次以避免因移液誤差、孵育、溫度和試劑濃度變化引起的差異?？瞻讓?duì)照組的數(shù)值需從測(cè)試值中減去。  

 

2. 基于圖中的點(diǎn)繪制最佳擬合曲線。  

 

3. 對(duì)于實(shí)驗(yàn)中獲得的吸光度值，從y軸該數(shù)值點(diǎn)作一條水平線延伸至最佳擬合曲線，在交點(diǎn)處作x軸的垂直線，得到x軸上的值（圖1）。 

 

圖1：標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合示例

 

4. 為保證數(shù)值準(zhǔn)確，細(xì)菌抗原的細(xì)胞數(shù)量或濃度需乘以稀釋倍數(shù)。  

 

5. 采用棋盤滴定分析法（checkerboard analysis）和較大的樣本量（每個(gè)樣品 4–5 個(gè)重復(fù)）驗(yàn)證 ELISA 測(cè)試，可檢測(cè)的內(nèi)容包括以下參數(shù)：  

 

a. 檢測(cè)限度（LoD）：測(cè)定方法能夠檢測(cè)到的最低抗原濃度。

 

b. 定量極限（LoC）：能夠以可接受的精密度和準(zhǔn)確度測(cè)量的抗原最高和最低濃度（在此范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)是有效的）。  

 

c. 加標(biāo)回收率（Spike Recovery）：用于檢測(cè)稀釋溶劑是否會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。如果將已知量的抗原加入稀釋溶劑中，在后期測(cè)量時(shí)應(yīng)該能等量回收；如果無法回收，意味著稀釋緩沖液可能與抗原發(fā)生了反應(yīng)。  

 

d. 準(zhǔn)確度（Accuracy）：測(cè)試結(jié)果均值與參考測(cè)量值之間的接近程度。  

 

e. 精密度（板內(nèi)精密度，Intra-assay Precision）：同一樣品多次測(cè)量之間離散程度的接近性（即技術(shù)性重復(fù)之間的誤差）。板內(nèi)精密度可以通過 Excel 或 GraphPad Prism 軟件、或酶標(biāo)儀自帶的軟件，使用標(biāo)準(zhǔn)差（SD）計(jì)算獲得。  

 

變異系數(shù)（CV）或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）用于計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)間結(jié)果的精密度。通常ELISA的CV值不應(yīng)超過10%，作者在這里認(rèn)為不應(yīng)超過15%。  

 

公式：CV = 標(biāo)準(zhǔn)差 / 均值 × 100

 

原作者在此強(qiáng)烈建議進(jìn)行棋盤滴定分析法計(jì)算用于 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化的抗原、一抗和二抗的用量。優(yōu)勢(shì)在于盡可能去除背景干擾，節(jié)約抗體使用（即使 ELISA 試劑盒中通常推薦較高濃度的抗體），并減少假陽性結(jié)果。

 

4 注意事項(xiàng)

 

1. 如需快速檢測(cè)且對(duì)靈敏度要求不高，宜將本方案耗時(shí)標(biāo)準(zhǔn)化為4小時(shí)。如對(duì)靈敏度有需要，可以通過以下方式對(duì)方案進(jìn)行優(yōu)化：

 

a. 提高抗體濃度

 

b. 延長孵育時(shí)間

 

c. 調(diào)整孵育溫度

 

d. 使用不同濃度的抗原（樣品）。

 

*需格外注意確?？贵w儲(chǔ)存于-20°C或更低溫度，并避免反復(fù)凍融。

 

2. 注意避免在孵育過程中孔板干燥?？蓪宸湃胗脻衩藁ㄤ伒椎暮兄斜３譂駶?。  

 

3. 捕獲抗體可以回收，并在實(shí)驗(yàn)中重復(fù)利用至少2次。游離抗體應(yīng)用螺旋蓋管收集，并儲(chǔ)存于-20°C。過夜孵育的效果比37°C室溫孵育相比更好?？墒褂?% BSA作為封閉液以避免假陽性結(jié)果。  

 

4. 在使用相同二抗的情況下提高檢測(cè)靈敏度的手段包括：延長孵育時(shí)間、提高溫度（最高至37°C）以及使用搖床。  

 

5. Ralstonia solanacearum的檢測(cè)靈敏度取決于樣品中的細(xì)胞濃度以及所使用的樣品類型。上述Ralstonia ELISA檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)到R. solanacearum的物種級(jí)水平，但無法區(qū)分小種（race）或生物型（biovar）。

 

此外，該測(cè)試也無法區(qū)分致病性和非致病性菌株。但一些商業(yè)試劑盒提供特定生物型的抗體，請(qǐng)根據(jù)ELISA檢測(cè)的具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。

 

6. 上述DAS-ELISA檢測(cè)的靈敏度極限最低達(dá)104至105 CFU/ml的R. solanacearum。該檢測(cè)方法對(duì)植物樣品和培養(yǎng)物中的病原體檢測(cè)最為敏感，但不適用于土壤樣品。如需檢測(cè)土壤中的R. solanacearum，需在富集過程中采用特定的緩沖液配方（如檸檬酸緩沖液）。  

 

7. 過量抗原可能導(dǎo)致“鉤子效應(yīng)”，即抗體不足以結(jié)合抗原導(dǎo)致信號(hào)減弱。因此，需要對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋以預(yù)估抗原濃度，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。  

 

8. 在讀取結(jié)果時(shí)孔板上如有氣泡存在，可能會(huì)引起誤差，因此在讀取前必須去除氣泡。在將微孔板放到酶標(biāo)儀上之前，同樣也需確保微孔板底部清潔。  

 

9. 對(duì)所有空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)試樣品都應(yīng)做三組技術(shù)重復(fù)，以便構(gòu)建準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。  

 

10. 注意保持無菌操作。實(shí)驗(yàn)過程中操作不到位和樣品交叉污染都可能導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的干擾和其他潛在問題。所有塑料器皿和玻璃器皿必須保持清潔。梯度稀釋過程中微量移液不準(zhǔn)確可能放大誤差。  

 

11. 高背景讀數(shù)可能有以下兩種原因：

 

a. 非特異性結(jié)合。解決方法是延長封閉時(shí)間或更換封閉試劑。封閉劑也可以添加到抗體緩沖液中以減少非特異性結(jié)合。

 

b. 通過棋盤滴定法降低一抗?jié)舛龋源_定最佳濃度。