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棲息在人體內(nèi)的復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)由細(xì)菌、古菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒組成，統(tǒng)稱為“微生物群”。LBPs既不是通過到達(dá)遠(yuǎn)端器官、組織或受體來發(fā)揮其生物效應(yīng)，也不會(huì)直接作用于已知的靶點(diǎn)。那么LBPs是怎么發(fā)揮作用的呢？一般認(rèn)為LBPs是通過調(diào)節(jié)宿主微生物群發(fā)揮作用，例如通過抑制病原體，產(chǎn)生活性分子/代謝物，調(diào)節(jié)粘膜免疫系統(tǒng)活性，激活上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞通路，或調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)。以上作用可全部或部分同時(shí)發(fā)生。還有一點(diǎn)很重要，LBPs能影響局部生態(tài)系統(tǒng)中的其他微生物與宿主的相互作用。此外，微生物群受環(huán)境（如壓力、營養(yǎng)或藥物等）影響很大，且微生物群具有宿主特異性。

監(jiān)管機(jī)構(gòu)首次提到LBPs是在歐洲藥典委員會(huì)2019年發(fā)布的3053E General monograph on Live Biotherapeutic Products中。不過，里面更多的是討論對(duì)這類產(chǎn)品質(zhì)量的要求。實(shí)際上，目前并沒有專門針對(duì)LBPs非臨床研究的指導(dǎo)原則。

由于微生物群組與宿主的共生關(guān)系高度復(fù)雜，并且具備高度的種屬特異性和依賴性，微生物群的任何差異都可能對(duì)宿主的生理學(xué)產(chǎn)生重大影響。這就使得動(dòng)物有效性和安全性研究結(jié)果的人體相關(guān)性和轉(zhuǎn)化性面臨很大挑戰(zhàn)。為解決這一問題，建議采用多種不同的方法表征LBP產(chǎn)品的安全性。

為了闡明LBP產(chǎn)品的MOA，通常會(huì)用一些體外的工具，如器官芯片、微流控技術(shù)等均可以考慮。如果LBP是局部皮膚外用，也有一些3D-皮膚模型或皮膚器官芯片技術(shù)可用。體內(nèi)工具則分為簡單動(dòng)物模型和哺乳動(dòng)物模型。簡單動(dòng)物模型包括果蠅或秀麗隱桿線蟲等。這類模型在評(píng)估LBP與宿主之間相互作用機(jī)制方面具備優(yōu)勢(shì)。哺乳動(dòng)物在LBP評(píng)價(jià)方面的缺點(diǎn)主要是人體相關(guān)性和臨床轉(zhuǎn)化效果比較差。畢竟，動(dòng)物與人體細(xì)菌之間的相互作用和共同進(jìn)化，與人體是有很大差異的。人體細(xì)菌移植到動(dòng)物體內(nèi)后，會(huì)逐漸向動(dòng)物宿主細(xì)菌成分轉(zhuǎn)化，雖然不會(huì)完全轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)物細(xì)菌，但最終會(huì)成為一個(gè)人體菌和動(dòng)物菌的混合菌。

LBPs幾乎不會(huì)進(jìn)入外周循環(huán)，故傳統(tǒng)的吸收、分布、代謝等試驗(yàn)并不是必須的。但是，需要了解LBPs給藥后，在新的環(huán)境中的分布、存活率、轉(zhuǎn)運(yùn)、生長、表型等。

那么LBPs產(chǎn)品非臨床研究究竟怎么開展呢？我們結(jié)合一個(gè)FDA和EMA雙報(bào)的案例看一下。

小克里斯滕森氏菌（Christensenella minuta）是一種革蘭氏陰性、不產(chǎn)生孢子、不運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌：屬于厚壁菌門。法國YSOPIA公司開發(fā)了Christensenella minuta DSM 33407，DP名為Xla1，擬用于治療肥胖和代謝相關(guān)疾病。基于其質(zhì)量、有效性和安全性數(shù)據(jù)分別于2019年和2020年與FDA和EMA開了pre-IND會(huì)議。

 

CMC

LBP開發(fā)起始于細(xì)菌菌株的分離、建庫和表征。這點(diǎn)類似于傳統(tǒng)生物藥物的建庫要求，建立RCB、MCB和WCB三級(jí)庫，后面兩級(jí)庫需要在GMP條件下建立，且需要充分表征和記錄。需要明確記錄菌株來源、菌株培養(yǎng)和傳代。如果菌株從人源生物材料分離，則人源供體的信息也要記錄，包括年齡、性別、一般生理狀況、健康狀況或病史、體重指數(shù)、無病原體以及采樣前一定時(shí)期的抗菌治療。

美國和歐洲對(duì)于菌株的表征主要從兩個(gè)方面考量，一個(gè)是基因型，一個(gè)是表型?；蛐捅碚鲀?nèi)容包括種屬鑒別、菌株鑒別、細(xì)菌耐藥基因、毒力基因、可移動(dòng)遺傳元件、質(zhì)粒、噬菌體相關(guān)DNA、轉(zhuǎn)座子等。表型表征的內(nèi)容則包括菌株鑒別、形態(tài)學(xué)鑒定、革蘭氏染色、細(xì)胞形態(tài)和大小、生長特征、運(yùn)動(dòng)和孢子形成、抗生素敏感性分析、酶活、細(xì)菌內(nèi)毒素等。有些檢測(cè)指標(biāo)如種屬鑒別、菌株鑒別，F(xiàn)DA甚至要求采用兩種方法交叉驗(yàn)證。

建庫之后下一步就是工藝開發(fā)。細(xì)菌培養(yǎng)是LBPs產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟，故需要對(duì)工藝過程進(jìn)行質(zhì)控。EMA強(qiáng)烈建議就臨床Ⅰ期樣品制備過程中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行過程控制，并建立接受標(biāo)準(zhǔn)。作為活的微生物，每種細(xì)菌尤其特定的生長需求，如培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)需要緊密控制。比如，厭氧菌不能通入氧氣。一些起始物料也必須按照GMP要求執(zhí)行。

為降低終產(chǎn)品機(jī)會(huì)性交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，開展微生物和菌株鑒別是確保LBPs產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的關(guān)鍵步驟。微生物檢查包括需氧微生物污染計(jì)數(shù)（AMCC）、酵母菌/霉菌混合污染計(jì)數(shù)（YMCC）和特定微生物的測(cè)試，如16S rDNA基因分型檢測(cè)。歐洲和美國藥典對(duì)LBPs的限度和檢測(cè)方法均有規(guī)定。

LBPs的批間差異比其他類型藥物要更大，而且終產(chǎn)品的穩(wěn)定性也不如其他藥物。FDA和EMA對(duì)這點(diǎn)都表示理解，未提出太多異議。

 

藥理毒理

Christensenella minuta DSM 33407開展的非臨床研究如下表所示。與傳統(tǒng)藥物相比，非臨床研究內(nèi)容簡單很多，主要原因是1）Christensenella minuta DSM 33407是一種人體共生菌，已有大量臨床數(shù)據(jù)；2）沒有任何動(dòng)物模型可以準(zhǔn)確模擬該菌株在人體胃腸道中的作用；3）為了盡可能重現(xiàn)人體微生物生態(tài)，構(gòu)建一個(gè)ex vivo GI SHIME模型。GI SHIME是什么？其實(shí)就是因?yàn)檫@類產(chǎn)品沒有合適的動(dòng)物模型，采用的一種人體腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器。GI SHIME模型，全稱為Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem（人類腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器），是一種高度復(fù)雜的動(dòng)態(tài)模擬系統(tǒng)，用于模擬人體胃腸道的生理、化學(xué)和微生物特性。該模型由五個(gè)主要部分組成：胃、小腸以及近端、橫段和遠(yuǎn)端結(jié)腸，能夠模擬食物從攝入到消化、吸收和發(fā)酵的全過程。SHIME模型的開發(fā)始于1993年，它不僅能夠模擬腸道微生物群落的組成和代謝活動(dòng)，還能模擬腸道內(nèi)環(huán)境參數(shù)的變化，如pH、氧化還原電位、營養(yǎng)物質(zhì)的可用性等。模型的運(yùn)作需要37℃的恒溫條件，通過蠕動(dòng)泵連接的雙層夾套玻璃容器，模擬食物在胃腸道中的流動(dòng)。每個(gè)階段的pH值都會(huì)根據(jù)胃腸道的實(shí)際條件進(jìn)行調(diào)節(jié)，并通過磁力攪拌器保持混合。這一生態(tài)模擬系統(tǒng)在Christensenella minuta DSM 33407的非臨床研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

每種細(xì)菌的生物學(xué)作用各不相同，因此其藥理學(xué)研究取決于細(xì)菌的特點(diǎn)。EMA和FDA均要求根據(jù)LBPs臨床擬用情況進(jìn)行非臨床研究的設(shè)計(jì)。不過，如前文所述，LBPs限于臨床前模型的缺失，很難實(shí)現(xiàn)這一目的。EMA建議先想辦法證明LBPs給藥后，是否引起病理生理學(xué)變化，以及MOA是什么。雖然LBPs的作用機(jī)制通常不是單一的，而是通過影響多種通路發(fā)揮作用。至少在進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前，先弄清楚LBPs是如何發(fā)揮作用的。這也是為什么一些人為構(gòu)建的器官模型派上了用場(chǎng)，如前面提及的SHIME模型。

藥代動(dòng)力學(xué)方面，對(duì)于LBPs，通常不會(huì)進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，并到達(dá)遠(yuǎn)端器官。因此，Christensenella minuta DSM 33407未開展傳統(tǒng)的PK研究，取而代之的是體外生物轉(zhuǎn)運(yùn)和宿主-微生物相互作用研究。FDA和EMA也認(rèn)可傳統(tǒng)的PK和TK研究對(duì)于LBPs并不適用。不過，要有數(shù)據(jù)證明受試菌株不能進(jìn)行系統(tǒng)循環(huán)，如細(xì)菌移位試驗(yàn)。

毒理研究方面，LBPs主要存在兩類風(fēng)險(xiǎn)，一種是抗生素耐藥轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)，一種是引發(fā)機(jī)體感染的風(fēng)險(xiǎn)。前者是一種重要的耐藥性傳播機(jī)制，包括轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。通過這些過程，耐藥基因可以從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，即使它們屬于不同的物種。例如，質(zhì)粒是一種常見的可移動(dòng)遺傳元件，可以攜帶耐藥基因并在細(xì)菌間傳遞。后者則是細(xì)菌可能通過移位進(jìn)入外周血，引發(fā)感染。由于缺乏可靠的非臨床模型，實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估很大程度上依賴于文獻(xiàn)資料收集。根據(jù)LBPs菌株特點(diǎn)、臨床目標(biāo)人群等對(duì)可能的獲益、風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索和綜述。

當(dāng)然，并不是任何毒理研究均不開展。Christensenella minuta DSM 33407開展了細(xì)菌移位試驗(yàn)。細(xì)菌移位指腸道細(xì)菌穿過腸黏膜屏障，進(jìn)入通常無菌的組織如腸系膜淋巴結(jié)以及其他器官的過程，可以用qPCR對(duì)相關(guān)組織進(jìn)行檢測(cè)。

FDA認(rèn)為開展的毒理研究支持Xla1的臨床Ⅰ期試驗(yàn)，現(xiàn)階段不需要開展額外的毒理試驗(yàn)。當(dāng)然，F(xiàn)DA同樣提示，如果本品在臨床開發(fā)過程中出現(xiàn)一些安全性風(fēng)險(xiǎn)的信號(hào)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)將會(huì)要求額外的毒理試驗(yàn)進(jìn)行支持。EMA則未給出清晰結(jié)論，只是反饋如果來源于健康的人類共生細(xì)菌，其攝入量在生理范圍內(nèi)，不能進(jìn)入外周系統(tǒng)循環(huán)，則不需要開展額外毒理研究。

關(guān)于GLP依從性，大部分毒理研究盡可能在GLP條件下開展。但是，一些厭氧菌需要特定的研究條件，很多GLP機(jī)構(gòu)不具備開展條件。這種情況下，監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受non-GLP條件下產(chǎn)生的毒理數(shù)據(jù)。但是，研究質(zhì)量并不能打折扣。而且，EMA額外強(qiáng)調(diào)，應(yīng)該討論偏離GLP條件可能產(chǎn)生的影響。