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1. 平均分子量介紹

GPC的測定對象為聚合物，聚合物一般是在一定的反應(yīng)條件下，由相同或者不同的單體形成的重復(fù)的、具有不同鏈長的高分子混合物，要對其進(jìn)行測定，就需要引入平均分子量的概念。

圖1 聚合物的形態(tài)（體型也叫做交聯(lián)型）

根據(jù)統(tǒng)計(jì)方式的不同，可以將平均分子量分為數(shù)均分子量、重均分子量和Z均分子量等概念，其中，數(shù)均分子量和重均分子量比較常用。數(shù)均分子量通常與材料、拉力和抗沖擊性相關(guān)；重均分子量通常與脆度相關(guān)；Z均分子量一般和彈性和硬度相關(guān)。以下為各分子量的概念：

數(shù)均分子量：按照分子數(shù)目統(tǒng)計(jì)平均計(jì)算的分子量，稱為數(shù)均分子量，以（1）表示（是數(shù)量上的平均）。 (1)

重均分子量：按照單位質(zhì)量統(tǒng)計(jì)平均計(jì)算的分子量，稱為重均分子量，以（2）表示（是質(zhì)量上的平均）。 (2)

Z均分子量：基于聚合物中每個單元重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)計(jì)算的分均分子量，稱為Z均分子量，以（3）表示。 (3)

峰頂點(diǎn)分子量：為色譜峰頂點(diǎn)時，對應(yīng)的分子量，以（4）表示。 (4)

多分散系數(shù)：多分散系數(shù)為重均分子量與數(shù)均分子量的比值，以D表示。

通常情況下，數(shù)均分子量＜峰頂點(diǎn)分子量＜重均分子量＜Z均分子量

下面，舉例說明數(shù)均分子量和重均分子量的計(jì)算：

①假設(shè)一個混合物中有5個分子，每個分子在數(shù)量上的占比均為1/5（也就是20%），他們的分子量分別為1000、2000、3000、4000和5000，那計(jì)算出的數(shù)均分子量為：

數(shù)均分子量=20%×1000+20%×2000+20%×3000+20%×4000+20%×5000=3000

②如果一個混合物中有3個分子，3個分子的分子量總重為10萬，他們的重量比例分別為3萬/10萬、2萬/10萬和5萬/10萬，也就是30%、20%和50%。

重均分子量=30%×3萬+20%×2萬+50%×5萬=3.8萬

2. 凝膠滲透色譜法（GPC）原理介紹

了解了上述的分子量的概念，就需要對GPC的原理進(jìn)行介紹。GPC是主要是基于分子排阻的原理，在色譜柱中進(jìn)行。固定相為凝膠態(tài)的多孔填料，分子樣品可以部分或全部進(jìn)入到孔徑內(nèi)部，根據(jù)溶劑化后的聚合物分子體積大小而先后排阻洗脫，洗脫時間與分子量大小一一對應(yīng)。通常來講，分子量越大，洗脫時間越短，GPC分離不依靠樣品與固定相之間的相互作用力。

GPC是根據(jù)聚合物溶劑化后的大小在色譜柱上進(jìn)行排阻的，如果聚合物溶劑化后的體積過大，就無法進(jìn)行色譜柱的凝膠孔隙中進(jìn)行排阻。如果溶劑化的聚合物大小剛剛能進(jìn)入凝膠孔隙，此時對應(yīng)的聚合物的分子量大小被稱為排阻限（排阻極限）。如果聚合物的體積很小，剛剛能從色譜柱的凝膠孔隙中穿透出來，此時對應(yīng)的聚合物的分子量大小被稱為滲透限（滲透極限）。2個限值表明了色譜柱可分析的分子量的范圍。

圖2 分子量大小與保留時間的關(guān)系

分子量大的聚合物在色譜柱中的排阻距離小，出峰時間早。分子量小的聚合物在色譜柱內(nèi)的排阻距離大，出峰時間比較晚。

3. 凝膠滲透色譜法（GPC）測定分子量的設(shè)備組成

GPC測定分子量的設(shè)備組成與常規(guī)的液相系統(tǒng)相似，檢測器一般為示差檢測器（若待測物有紫外吸收，也可選擇紫外檢測器），軟件部分需要配備相應(yīng)的GPC數(shù)據(jù)分析軟件。

4. 凝膠滲透色譜法（GPC）分析要點(diǎn)

GPC的分析步驟常見如下：

首先：根據(jù)樣品特點(diǎn)選擇1）溶解溶劑和流動相，2）色譜柱種類，3）色譜柱的大小和規(guī)格，4）標(biāo)準(zhǔn)品的類型和分子量大小，5）校正方法

其次：配制標(biāo)樣和樣品，上機(jī)測試，得到合適的色譜圖

最后：進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用GPC軟件分析獲得的數(shù)據(jù)

4.1 溶解溶劑/流動相的選擇

4.1.1溶劑（流動相）類型：通常溶劑的選擇是根據(jù)樣品的特性選擇的，依據(jù)相似相溶的原理，通常能溶解，即可用于測定。通常選擇低黏度和低沸點(diǎn)的溶劑，要求能充分溶解樣品且不會與色譜柱的固定相發(fā)生互溶，常見的GPC使用溶劑有四氫呋喃、氯仿、二甲基亞砜和水等，四氫呋喃是很多塑料的良溶劑。

4.1.2純度要求：一般要求溶劑的純度在HPLC級別及以上，要求必須進(jìn)行本底溶劑測試，觀察是否會在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的出峰位置出現(xiàn)干擾峰，影響樣品的檢測。

4.1.3緩沖鹽的濃度和純度：有時需在溶劑或流動相中加入鹽試劑，比如在水中加入硝酸鈉鹽，在DMF中加入溴化鋰鹽。隨著鹽濃度的增加，聚合物分子狀態(tài)從伸展構(gòu)象變成無規(guī)線團(tuán)（無規(guī)線團(tuán)是最接近聚合物分子最真實(shí)的狀態(tài)），且緩沖鹽可以減少分子所帶的靜電荷，減弱離子包容和離子排斥作用對分子量測定產(chǎn)生的影響。但鹽濃度過大，也會對色譜系統(tǒng)產(chǎn)生一些負(fù)面影響，導(dǎo)致色譜柱的壓力增加、柱效降低且會較快地縮短色譜柱的壽命，故水相中鹽濃度通常在0.1-0.5mol/L之間，DMF中通常小于20mmol/L。

4.1.4樣品的溶劑：最好選擇流動相溶解樣品，如果不能，需要與流動相類似，并可以互溶。

4.1.5 注意事項(xiàng)：

流動相更換時，互溶性較差，就需要中間溶劑進(jìn)行過渡。

需要選擇與檢測器匹配的流動相（如果是紫外檢測器，要注意流動相的末端吸收）。

流動相需要脫氣后，才能正常使用。

盡可能避免使用含有鹵素離子的緩沖液，因鹵素離子會腐蝕不銹鋼系統(tǒng)。

如果使用高濃度的四氫呋喃、二甲基亞砜等溶劑作為流動相，需要匹配能耐受的管路。

4.2 色譜柱的選擇

4.2.1根據(jù)樣品所使用的溶劑和流動相選擇色譜柱的類別，同時需要與標(biāo)準(zhǔn)品匹配

4.2.2 除了溶劑之外，還需要根據(jù)樣品分子量范圍來選擇色譜柱的規(guī)格，樣品分子量應(yīng)處于排阻限和滲透限范圍內(nèi)，且最好處在校正曲線范圍內(nèi)。

4.2.3 色譜柱的分類：

普通凝膠柱：相對于混合凝膠柱在一段時間內(nèi)校正曲線呈線性

混合凝膠柱：在比較寬的范圍內(nèi)都呈現(xiàn)線性

4.2.4 色譜柱的安裝：

有時為了擴(kuò)大測定的分子量的范圍，可以將色譜柱串聯(lián)，一般串聯(lián)的時候需要將排阻限大的色譜柱接在前面，通常而言，分析結(jié)果與色譜柱安裝的順序沒有太大的關(guān)系，將排阻限大的色譜柱安裝在之前，是因?yàn)樯V柱的孔徑越大，對外來污染物的承受能力就越強(qiáng)。

串聯(lián)安裝時，還需要考慮色譜柱的壓力耐受范圍，設(shè)置的最大壓力應(yīng)該根據(jù)耐壓能力較低的色譜柱來設(shè)定。

4.2.4 色譜柱選擇的注意事項(xiàng)：

色譜柱的分子量排阻限與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的分子量不匹配時，就會出現(xiàn)異常情況。

聚合物的分子量應(yīng)該均勻地落在色譜柱組的線性范圍內(nèi)，高分子量端平穩(wěn)抬起，低分子量端平穩(wěn)下降。

如果凝膠柱組孔徑過大，小孔徑的填料不足，就會出現(xiàn)分子中小分子組份與晚出峰的聚合物部分重疊。

如果凝膠柱組孔徑過小，大孔徑的填料不夠，就會出現(xiàn)高分子量端有隆起現(xiàn)象，且出峰時間靠前。

4.3  標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇是根據(jù)樣品的溶解溶劑來選擇的，一類溶解在水中，采用水相作為流動相，叫做水溶性樣品；另外一類溶解在有機(jī)溶劑中，采用有機(jī)溶劑作為流動相，叫做油溶性樣品。

4.3.2常見的標(biāo)準(zhǔn)品

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，常溶解于有機(jī)溶劑中）

聚苯乙烯（PS，最為普遍，溶解于各種的有機(jī)溶劑中）

聚乙二醇（PEG，溶解于有機(jī)溶劑和水中）

聚環(huán)氧乙烷（PEO，又被稱為氧化乙烯，可以溶解于有機(jī)溶劑及水中）

普魯蘭（溶于水中）

葡聚糖（溶于水中）

蛋白質(zhì)（溶于水中）

具體的各種溶劑和其對應(yīng)溶解的標(biāo)準(zhǔn)品如下表所示

4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制及其注意事項(xiàng)

配制標(biāo)準(zhǔn)品時，為節(jié)約分析時間，可以將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量高低，兩兩分組（需確認(rèn)色譜峰能完全分離）。（例如：將分子量從高到低排序分為1~6，那么3和6一起配制，2和5一起配制，1和4一起配制）

至少選擇5個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)樣品

進(jìn)樣前，需要采用0.45μm的濾膜過濾

進(jìn)樣體積在20~100μl之間

標(biāo)準(zhǔn)品溶解的時候，不能加熱，也不能振蕩超聲，需要靜置溶解（快速溶解的樣品，會導(dǎo)致分子量較大的化合物的鍵斷裂，導(dǎo)致測定結(jié)果的異常）

綜合來講，在保證樣品的基本信號強(qiáng)度可以識別的情況下，聚合物溶液的濃度越稀越好。因?yàn)榉肿恿吭酱蟮幕衔?，濃度增加的越快，半峰寬展開的也比較快，峰就越寬。且分子量越大的化合物，濃度越高時，對保留時間也會有影響，洗脫體積越大，保留時間會被延長，導(dǎo)致最后測定的分子量比較偏小。

4.4 校正方法的選擇

常見的校正方法有兩種，窄分布校正法和普適校正法。

4.4.1 窄分布校正法

選擇與被測樣品結(jié)構(gòu)相同或者相似的標(biāo)準(zhǔn)樣品（分散性D≤1.1），先用其他方法精準(zhǔn)測定其相對平均分子質(zhì)量，然后與被測樣品在相同的條件下進(jìn)行GPC的分析。

主要用于無支鏈型分子量的校正，要求樣品最好與標(biāo)樣是相同或者相近的結(jié)構(gòu)。

①窄分布校正情況分類：

如果樣品與標(biāo)樣的結(jié)構(gòu)完全一致，就無需進(jìn)行校正（例如采用聚乙二醇系列標(biāo)樣測定聚乙二醇4000的平均分子量）。

如果樣品與標(biāo)樣結(jié)構(gòu)不一致，且樣品帶有支鏈，則無法用窄分布校正法。

如果樣品與標(biāo)樣結(jié)構(gòu)不一致，但是樣品是單鏈結(jié)構(gòu)，則可以用QF因子比來修正結(jié)果。

②QF因子比定義與具體的計(jì)算方法

QF因子：指的是單位鏈長分子量（僅僅適用于單鏈聚合物）

QF因子比：樣品與標(biāo)準(zhǔn)品單位鏈長分子量的比值

校正時，在對應(yīng)的GPC軟件處輸入QF因子比即可。

4.4.2 普適校正法

①普適校正法的原理

GPC反映的是淋洗體積與高聚物流體力學(xué)體積之間的關(guān)系，根據(jù)Flory-Fox的方程：

 （5）

其中，[?]為高分子的特性黏度，rg為根均方半徑，M為高分子的分子量，Φ為常數(shù)，將公式（5）變更，得到：

 （6）

其中，[?]M為線團(tuán)體積的函數(shù)，我們記作ƒ（V），將Mark-Houwink方程（7）代入公式（6），得到方程（8）：

 （7）

 （8）

說明只要淋洗體積相同，不同分子量的KMα+1數(shù)值是一致的。大量的實(shí)踐也證明，具有相同淋洗體積的不同高分子流體力學(xué)體積相等[1]，假設(shè)用已知高分子的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來測定未知物質(zhì)，可以得到：

 （9）

式中，K，α是Mark-Houwink方程中的參數(shù)，下標(biāo)1、2分別代表標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與待測高分子，若標(biāo)準(zhǔn)高分子的重均分子量M1與其K1和α1已知，且待測高聚物的K2，α2也可以得到，那就就可以根據(jù)上述公式測定得到待測高分子聚合物的真實(shí)分子量M2。

②普適校正法的注意事項(xiàng)

適用于有支鏈的化合物，但只有非離子型的高分子才可以用普適校正法

選用的溶劑一般是有機(jī)溶劑，常見的有四氫呋喃、鄰二甲苯、氯仿和甲苯

待測物和標(biāo)準(zhǔn)品的K值和α值均要求在相同條件下得到（可用粘度法測定得到，也可以查找高分子材料的工具書中得到）

當(dāng)待測樣品在色譜柱的分離過程中存在除了分子排阻外的其他分離機(jī)理時，不適用。

4.4.3 計(jì)算

采用合適的校正方法，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，輸入對照品的峰頂點(diǎn)分子量值，進(jìn)行對數(shù)擬合，擬合出合適的校正曲線。運(yùn)行樣品后，可以得出樣品的數(shù)均分子量、峰頂點(diǎn)分子量、重均分子量、Z均分子量和分子量分布。

4.5 其他

4.5.1 柱溫

適當(dāng)升高柱溫，可以充分溶脹GPC色譜柱中的凝膠，讓聚合物分子的溶解度增加，減少色譜柱對聚合物分子的吸附，同時降低其黏度，增加擴(kuò)散速度，提高柱效。一般來說，提高柱溫時，對小分子物質(zhì)的測試效果的影響比較小，但對大分子物質(zhì)的影響比較大。

柱溫也不可過高，容易造成凝膠的老化，且對色譜系統(tǒng)的影響也比較大，一般柱溫控制在30~50℃，對試驗(yàn)結(jié)果的影響比較小。

某些聚合物在最低臨界溶解溫度以上時分子線團(tuán)尺寸變大，測定該類對溫度敏感的聚合物，要求柱溫低于最低臨界溶解溫度，可有效避免線團(tuán)變大帶來的影響[2]。

4.5.2 樣品濃度

上文我們提到，當(dāng)樣品濃度過高，會阻礙分子的擴(kuò)散，影響半峰寬和保留時間，甚至導(dǎo)致色譜柱的超載。同時，樣品濃度的選擇還應(yīng)該考慮所用檢測器的靈敏度，濃度過低，檢測器的響應(yīng)較弱，比較容易產(chǎn)生誤差。

在合適的濃度下，淋出體積（保留時間）與分子量大小呈線性關(guān)系，一般樣品的質(zhì)量濃度在1~3mg/ml時得到的數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性相對較好，測定分子量與分子量分布的準(zhǔn)確度比較高。有時，配制濃度也可放寬至0.05~0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

5. 影響GPC測定聚合物分子量大小的其他因素

5.1 在排阻色譜中存在的其他的相互作用

5.1.1 填料與樣品的相互作用

疏水性吸附作用：樣品可能被填料吸附，洗脫變慢，使得分子量的計(jì)算結(jié)果變小

排斥性作用：有可能存在離子排斥，靜電排斥等，被填料排斥，使得洗脫變慢，分子量的計(jì)算結(jié)果變大

5.1.2 樣品本身、不同樣品間的相互作用

聚合物分子內(nèi)部離子排斥：聚合物內(nèi)部包裹了金屬離子，使得聚合物分子變大，分子鏈變大，導(dǎo)致洗脫變快，分子量的計(jì)算結(jié)果變大。

聚合物分子之間的結(jié)合：使得分子量的測定結(jié)果變大。

5.1.3 判斷是否存在相互作用的一些方法

色譜峰的形狀也是重要的判斷標(biāo)準(zhǔn)，測試中色譜峰峰形對稱，呈正態(tài)分布（無拖尾和前沿）的，其吸附或者排次的可能性小。

不同進(jìn)樣量的比值與不同進(jìn)樣量下的峰面積的比值，兩個數(shù)值越接近，則相互作用越小。

同樣的進(jìn)樣量下，不連接色譜柱和連接色譜柱的峰相應(yīng)大小，兩個數(shù)值越接近，則流動相（淋洗液）越合理。

5.1.4 存在相互作用時，如何抑制和消除

關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與色譜柱填料的匹配性

添加鹽、降低離子排斥作用，如氯化鈉、硝酸鈉、氯化鋰、溴化鋰、三氟乙酸鈉等等

可加入適量的甲醇或乙腈等強(qiáng)極性溶劑，抑制親水性相互作用

對于高分子量的樣品，在信號強(qiáng)度適當(dāng)?shù)那疤嵯?，降低樣品的濃度?/span>

5.1.5 油溶性聚合物分子量的測定應(yīng)用

分子中不含親水性片段的油溶性聚合物，一般將四氫呋喃作為流動相的首選，常見的有聚氟乙烯和聚苯乙烯。若分子中存在親水性基團(tuán)（如端基或者支鏈中含有羧基），但該基團(tuán)對整個高聚物的淋出體積影響較小，也可以用四氫呋喃直接測定。如果影響較大，就需要加入一定抑制劑，減弱相互作用。如，加入10%的乙酸的四氫呋喃作為苯乙烯和衣康酸共聚物測定的淋洗液。[1]

研究發(fā)現(xiàn)，直接用四氫呋喃作為淋洗液，測定一些含氮原子的高聚物的分子量，可能會比較困難，這就可以在淋洗液中加入適量的含氮小分子，可以抑制固定相的吸附作用，達(dá)到滿意的效果。

在非極性高聚物分子量的測定過程中，除了可以加入適量醋酸外，還可以往四氫呋喃中混合其他強(qiáng)極性的溶劑作為淋洗液，如甲醇和乙腈等。但是加入強(qiáng)極性溶劑后，需要平衡待測物的溶解度與溶質(zhì)的優(yōu)先溶劑化的關(guān)系。

有時也可以采用衍生的方法，當(dāng)強(qiáng)極性基團(tuán)存在于高分子鏈上而不能直接測定時，可用衍生化方法處理。

5.1.6水溶性聚合物分子量的測定應(yīng)用

影響水溶性聚合物淋洗體積的主要因素有氫鍵、帶電荷的離子包容、離子排斥和疏水相互作用。

當(dāng)氫鍵相互作用較為嚴(yán)重時，樣品的淋洗體積大于溶劑淋洗體積（出峰在溶劑峰之后），無法得到測定結(jié)果，因此，可以在淋洗液中加入適量的尿素、乙二醇、低分子量的聚乙二醇等，抑制氫鍵的相互作用。

離子包容和離子排斥作用對分子量的測定也有一定的影響。當(dāng)高分子電解質(zhì)的凈電荷不為零時，易同色譜柱所帶的電荷發(fā)生相互作用。離子包容使得分子量的測定值偏低，離子排斥使得測定值偏高。提高淋洗液的離子強(qiáng)度可以減弱這兩種因素對分子量測定的影響。調(diào)節(jié)淋洗液的pH、加入適量的鹽可以都可以減少或消除離子作用。

此外，當(dāng)高分子溶質(zhì)和GPC色譜柱的填料之間存在較強(qiáng)的疏水作用時，被測高分子聚合物就無法或者難以進(jìn)入適當(dāng)大小的凝膠孔中，導(dǎo)致淋出體積偏小，測定的結(jié)果偏高。根據(jù)不同的高分子類型，可以在水溶性的淋洗液中添加適當(dāng)?shù)囊译?、甲醇或者四氫呋喃來消除這種疏水相互作用。

5.2 標(biāo)準(zhǔn)品帶來的差異

選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品，也是測定平均分子量結(jié)果準(zhǔn)確可靠的因素之一。故在方法中，一定要明確所選擇的標(biāo)準(zhǔn)品的種類。

5.3 檢測系統(tǒng)的影響

溶劑替換：溶劑需要替換完全，如果兩種溶劑不相容，就得選擇第三種溶劑進(jìn)行替換。

系統(tǒng)沖洗：用過緩沖液的系統(tǒng)，若長時間停用，需用水或有機(jī)溶劑沖洗系統(tǒng)和色譜柱，最后用四氫呋喃或甲醇或其他有機(jī)溶劑充滿各個管路。

RID平衡操作：需要反復(fù)平衡流通池和參比池，直至兩者完全平衡，注意需要信號歸零。

色譜柱也需要平衡到位，使得壓力穩(wěn)定。

若系統(tǒng)平衡不充分，就易帶入氣泡，產(chǎn)生倒峰。

5.4 保留時間穩(wěn)定（溫度、儀器狀態(tài)等）

保留時間與分子量的對數(shù)呈現(xiàn)線性關(guān)系，保留時間的波動對測定結(jié)果的影響非常大。為了維持保留時間的恒定，除了需要對淋洗液進(jìn)行脫氣處理外，還需要維持溫度和儀器狀態(tài)的穩(wěn)定。

環(huán)境溫度通常維持在25℃；柱溫箱溫度一般在30~50℃，通常設(shè)置為40℃；分析期間柱溫箱門必須關(guān)閉。檢測器溫度與柱溫箱溫度相同，分析期間檢測器門窗必須關(guān)閉。且檢測器放置的位置需要避開空調(diào)的出風(fēng)口。

5.5 校正曲線的有效性

因標(biāo)準(zhǔn)品的成本較高，有些情況下不會在運(yùn)行樣品時隨行進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品。若未進(jìn)行隨行標(biāo)曲，就需要每周用標(biāo)樣評價標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果偏差大于0.10M，就需重新進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測。

更換或添加色譜柱，需要重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測試條件有任何的改變（如溫度、流速等），均需重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考文獻(xiàn)：

[1]丁生龍，從勇，高春梅，劉明珠.凝膠滲透色譜在高聚物分子量測定中的應(yīng)用。

[2] 段英慧.聚合物分子量測定方法的進(jìn)展。

[3] USP:2.2.30. Size-exclusion chromatography

[4]《中國藥典》0514 分子排阻色譜法