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Bradford法，即考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，是非常老生常談的實驗手段。但由于Bradford法靈敏度很高，仍有一定操作導(dǎo)致玄學(xué)的空間。在此介紹一個來自Springer Protocol的標(biāo)準化方案。

2. 實驗原理

 

Bradford法使用考馬斯亮藍-G作為染料。蛋白質(zhì)分子在酸性條件下與考馬斯亮藍染料結(jié)合，由于蛋白質(zhì)分子中組氨酸、精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸與其發(fā)生反應(yīng)，將產(chǎn)生染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物，顏色從棕色變?yōu)樗{色，可被分光儀檢測到。蛋白質(zhì)濃度越高，藍色的強度就越高。此法簡單快速靈敏度高，且受到緩沖液成分干擾的影響較小，具有很強的優(yōu)勢。

 

（圖片來源：https://www.bioagilytix.com/blog/utilizing-bradford-assay-for-protein-concentration-calculation/）

此法依然有缺點，即此反應(yīng)基于組氨酸、精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸發(fā)生反應(yīng)，如果待測蛋白質(zhì)分子中此類氨基酸與蛋白質(zhì)分子的平均數(shù)據(jù)有較大偏差，則無法準確測定。

3. 實驗材料

 

所需設(shè)備：

● 移液器

● 玻璃比色皿

● 紫外分光光度計

試劑與耗材：

● 考馬斯亮藍G

● 100%乙醇

● 磷酸

● 用于繪制標(biāo)準曲線的BSA

● 稀釋緩沖液

● 待測蛋白樣品

● 超純水

● Whatman 1號濾紙

Bradford試劑制備：

1. 將 40mg 考馬斯亮藍-G溶解在 20mL 100%乙醇中，攪拌20分鐘；

2. 繼續(xù)添加 40mL 磷酸和 340mL 超純水；

3. 用Whatman 1號濾紙過濾上述溶液兩次；

4. 將所得溶液儲存于棕色瓶中，存放于 4℃ 條件下。

*注意所有步驟都需要避光

4. 實驗步驟

 

*樣本需按用量需求分裝，每次使用一管，在冰上解凍。

1. 使用BSA配制不同稀釋度（從1μg到20μg）的樣本用于檢測并繪制在 595nm 處的吸光度標(biāo)準曲線。下圖提供了一種標(biāo)準化的配方。

圖1：引用自原文。三列配方數(shù)據(jù)從左到右分別為：稀釋緩沖液、Bradford試劑、BSA標(biāo)準品。

2. 根據(jù)繪制出的標(biāo)準曲線，再次測定緩沖液-待測樣本混合液在 595nm 處的吸光度，于標(biāo)準曲線上檢索得到待測樣本的蛋白質(zhì)濃度。

5. 標(biāo)準曲線繪制

 

以X軸為濃度（以mg/mL為單位）、Y軸為吸光度（OD595），使用BSA標(biāo)準品的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準曲線。為確保精度，需擬合最佳曲線。示例如下圖。

圖2：引用自原文。左側(cè)為一組BSA標(biāo)準品的數(shù)據(jù)，右側(cè)為基于左側(cè)數(shù)據(jù)擬合的標(biāo)準曲線。

6. 注意事項

 

1. Bradford法的高靈敏度適用于較低的蛋白質(zhì)濃度。如果待測樣本的濃度超出可檢測的范圍，應(yīng)先進行梯度稀釋，稀釋到吸光度落入可檢測的有效范圍；

2. 樣本中的表面活性劑（如總蛋白提取緩沖液中就存在）會干擾此法檢測效果；

3. 注意在1小時內(nèi)檢測吸光度，保證三個技術(shù)性重復(fù)；

4. 移液操作需要精準，因為Bradford本身就是用于測量低濃度蛋白質(zhì)，移液操作的失誤可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)玄學(xué)

5. 需注意待測蛋白中的組氨酸、精氨酸和賴氨酸含量是否與平均水平有較大偏差，如果有則不能使用Bradford法，可結(jié)合具體分子考慮Lowry法、BCA法或紫外分光法。

7. 參考文獻

 

Varsha Gupta and Baishnab Charan Tripathy, 2020, Detection of Phosphoproteins (Phosphoserine and Phosphothreonine) from Thylakoid Membranes Using Western Blotting, from Experimental Protocols in Biotechnology, P143-145, Humana Press