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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-05-19 20:08
摘 要：建立高效液相色譜法測定化妝品原料三肽-1銅（GHK-Cu），進而考察原料的高溫及光照穩(wěn)定性。以0.1%三氟乙酸溶液為溶劑溶解樣品，經(jīng)CAPCELL PAK ADME C18色譜柱分離，流動相為0.1%三氟乙酸溶液，等度洗脫，流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，采用DAD檢測器測定，檢測波長為217 nm，進樣體積為10 μL，以色譜峰面積外標法定量。三肽-1的質(zhì)量濃度在0.937 5～93.75 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 9， GHK-Cu的檢出限為1.1 ng，定量限為3.3 ng。樣品加標回收率為100.2%～102.1%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.58%（n=9）。該方法能夠滿足三肽-1銅的快速、準確測定要求。
關鍵詞：三肽-1銅；高效液相色譜法；化妝品原料
近年來，隨著國家政策的扶持及電商的猛然崛起，我國化妝品行業(yè)發(fā)展勢頭銳不可擋，其中，具有抗衰功效的功效性化妝品備受消費者青睞。三肽-1銅(GHK-Cu)能安全有效地作用于人體皮膚及毛發(fā)，直接幫助膠原蛋白及糖胺聚糖的合成，具有優(yōu)異的抗衰老作用[
GHK能促進大鼠肝細胞的存活率和肝癌細胞的生長，影響細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，因此被稱作肝細胞的生長因子[
GHK-Cu原料因其合成工藝的不同而質(zhì)量參差不齊，亟需一種快速簡便的檢測方法來定量。目前針對GHK-Cu的報道多為合成純化及藥理作用研究，相關檢測方法報道較少。目前僅檢索到兩篇中文文獻，報道了采用液相色譜法測定GHK-Cu[
1.實驗部分
1.1主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津?qū)嶒瀺u器材有限公司。
超純水機：Milli-Q型，美國密理博公司。
電子天平：MS105DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
數(shù)控超聲儀：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。
紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用公司。
三肽-1標準品：質(zhì)量分數(shù)為85.0%，批號為20201104，山東濟肽生物科技有限公司。
磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
三氟乙酸：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司。
實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水機制備。
待測樣品：由濟肽生物有限公司提供。
1.2色譜條件
色譜柱：CAPCELL PAK ADME C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，資生堂(中國)投資有限公司]；流動相：0.1%三氟乙酸溶液；流量：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測器：DAD檢測器；檢測波長：217 nm；柱溫：30 ℃。
1.3溶液配制
對照品儲備液：1.875 mg/mL，精密稱定三肽-1標準品110.32 mg，置于50 mL容量瓶中，加入0.1%三氟乙酸溶液，超聲溶解后定容至標線，搖勻。
系列標準工作溶液：三肽-1質(zhì)量濃度分別為0.938、4.688、9.375、18.75、46.88、93.75 μg/mL。分別準確移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL對照品儲備液至6只100 mL容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液稀釋定容至標線，混勻。
樣品溶液：取混勻的樣品約20 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入0.1%三氟乙酸溶液，超聲溶解后定容至標線，搖勻，作為樣品溶液。
空白樣品溶液：用不含三肽-1銅的空白樣品，按樣品溶液制備方法制備空白樣品溶液。
1.4測定方法
取系列標準工作溶液和樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣分析，計算色譜峰面積，以系列標準工作溶液中目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，按外標法計算樣品中目標物的含量。
2.結(jié)果與討論
2.1檢測波長選擇
精密吸取三肽-1對照品儲備液適量，加水稀釋，配制成含三肽-1的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，以水為空白溶劑校對零點，用紫外分光光度計，在190～400 nm 波長范圍內(nèi)對該溶液進行掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，三肽-1在217 nm處吸光度最大，故選擇檢測波長為217 nm。
圖1三肽-1紫外吸收光譜圖Fig. 1UV absorption spectrum of Tripeptide-1
2.2色譜柱選擇
三肽-1銅分子極性較大，在一般流動相和色譜柱中很難保留。分別考察普通C18柱和CAPCELL PAK ADME C18柱對三肽-1的保留行為。結(jié)果表明，普通C18柱對三肽-1保留效果及色譜峰形均較差；鍵合了籠狀結(jié)構(gòu)金剛烷胺基團的CAPCELL PAK ADME C18柱，在保持填料疏水性的同時，提高了表面極性，有助于提高強極性化合物的分離效果，延長了三肽-1的保留時間且色譜峰形良好，因此選擇CAPCELL PAK ADME C18色譜柱進行分離。
2.3流動相選擇
CAPCELL PAK ADME C18色譜柱可以在100%水相條件下使用，先采用磷酸鹽緩沖液作為流動相等度洗脫，考察不同pH值下GHK-Cu的出峰情況。結(jié)果顯示，pH值小于6或大于7時色譜峰形分叉，pH值為6～7時可得到單一色譜峰，但峰形較寬、較差，存在干擾，不利于定量。
采用體積分數(shù)為0.1%的三氟乙酸溶液(pH值約為2.0)作為流動相等度洗脫，考察GHK-Cu的分離效果。結(jié)果顯示，GHK-Cu完全解離為GHK和Cu2+，且GHK和Cu2+的色譜峰形及分離度均較好，能準確定量GHK-Cu并確定二者比例，因此選擇0.1%三氟乙酸溶液為流動相。
2.4專屬性試驗
在1.2色譜條件下，分別測定空白樣品溶液、標準溶液、樣品溶液，考查方法的專屬性及系統(tǒng)適用性，結(jié)果如圖2所示。由圖2中可以看出，在該色譜條件下，GHK-Cu及雜質(zhì)可以實現(xiàn)完全分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000。
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圖2空白樣品溶液、標準溶液和樣品溶液色譜圖
Fig. 2Chromatograms of blank solution，standard solution and
sample solution
2.5線性方程、檢出限和定量限
在1.2儀器工作條件下，對系列標準工作溶液進行測定，以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。結(jié)果表明，
GHK的質(zhì)量濃度在0.937 5～93.75 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關系，線性方程為y=8 344.90x+610.529，相關系數(shù)為0.999 9。
取系列標準工作溶液中最低質(zhì)量濃度點的溶液，用水逐級稀釋后測定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限，得該方法的檢出限為0.093 8 μg/mL，定量限為0.281 4 μg/mL。當進樣體積為10 μL時，GHK的檢出限為0.938 ng，定量限為2.814 ng。GHK-Cu中GHK與Cu2+是1∶1結(jié)合，換算成GHK-Cu的檢出限為1.1 ng，定量限為3.3 ng。
2.6加標回收與精密度試驗
取約12 mg樣品，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，平行稱取9份，加入不同質(zhì)量的三肽-1，進行高、中、低3個水平的加標回收試驗。按1.3方法制備加標樣品溶液，在1.2儀器工作條件下測定，計算回收率和測定結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表1。由表1可知，三肽-1的加標平均回收率為101.4%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.58%。表明該方法準確性和精密度良好。
表1樣品加標回收與精密度試驗結(jié)果
Tab. 1Results of sample spiked recovery and precision test
2.7溶液穩(wěn)定性試驗
按1.3方法制備樣品溶液，分別在第0、2、4、8、12、24h進樣測定，結(jié)果見表2。由表2可知，三肽-1色譜峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差為0.03%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
表2樣品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Tab. 2The stability test results of sample solution
2.8樣品熱穩(wěn)定性及光照穩(wěn)定性試驗
取某廠家提供的藍色晶體原料，置于40 ℃烘箱中保存，分別在第7、28、84 d測定GHK-Cu的含量并與初始含量比較，考察其熱穩(wěn)定性；將原料置于照度為4 500 lx的光照箱內(nèi)，分別于第7、28、84 d測定GHK-Cu的含量并與初始含量比較，考察其光照穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。由表3可知，經(jīng)84 d的熱穩(wěn)定性和光照穩(wěn)定性試驗，樣品中GHK-Cu的質(zhì)量分數(shù)分別為初始值的96.2%、95.7%，表明在84 d內(nèi)該藍色晶體原料穩(wěn)定性良好，能夠滿足后續(xù)化妝品制劑調(diào)配的要求。
表3樣品熱穩(wěn)定性及光照穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Tab. 3Results of thermal stability and light stability test
3.結(jié)語
建立了高效液相色譜測定化妝品原料GHK-Cu含量的方法。該方法簡捷、準確、高效，解決了GHK-Cu質(zhì)量控制及優(yōu)劣評價方法缺失的難題，可為化妝品原料GHK-Cu的質(zhì)量控制提供技術保障。
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LIN Yujia,YU Haiying,DIAO Feiyan,ZHANG Liangyu,WANG Weijian,LI Qiyan
（Shandong Institute for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Evaluation of Cosmetic Raw Materials,Jinan Engineering Research Center for Cosmetics of Specialty Plant Resources, Industrial Technology Foundation Public Service Platform, Jinan 250101, China）
Abstract:A method for the determination of cosmetics raw materials copper tripeptide-1 (GHK-Cu) by high performance liquid chromatography was established, and to investigate its high temperature and light stability. After dissolving in 0.1% trifluoroacetic acid solution, the samples were separated by CAPCELL PAK ADME C18column. 0.1% trifluoroacetic acid solution was used as the mobile phase with isocratic elution, the flow rate was 1.0 mL/min, and the column temperature was 30 ℃. The samples were determined by DAD detector, the detection wavelength was 217 nm, and the sample volume was 10 μL. Quantify by chromatographic peak area external standard method. The mass concentration of tripeptide-1 had a good linear relationship with the chromatographic peak area in the range of 0.937 5-93.75 μg/mL, and the correlation coefficient was 0.999 9. The detection limit of GHK-Cu was 1.1 ng, and the quantification limit was 3.3 ng. The recoveries of samples spiked were 100.2%-102.1%, and the relative standard deviation of the measurement results was 0.58% (n=9). This method can meet the requirements of rapid and accurate determination of copper tripeptide-1.
Keywords:copper tripeptide-1；high performance liquid chromatography；raw materials of cosmetics
引用本文：林鈺鎵，于海英，刁飛燕，等 . 高效液相色譜法測定化妝品原料三肽-1銅［J］. 化學分析計量，2025，34（1）： 71.(LIN Yujia, YU Haiying, DIAO Feiyan, et al. Determination of cosmetics raw materials copper tripeptide-1 by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 71.)
來源：化學分析計量
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