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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-05-20 20:24
摘 要： 建立一測多評法同時測定玉屏風制劑中升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮8種成分的含量。以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流量為1.1 mL/min，進樣體積為10 μL，檢測波長為220 nm。8種成分的色譜峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.999。樣品加標平均回收率為91.7%～102.1%，測定結果的相對標準偏差為0.57%～1.62%（n=6）。以5-O-甲基維斯阿米醇苷為內參照物，計算升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮的相對校正因子分別為1.009，1.925，2.147，0.822，0.708，1.066，1.425。分別采用外標法與一測多評法測定18批樣品，8種成分的測定結果無顯著性差異（p＞0.05）。該方法準確、可靠、便捷，可用于玉屏風制劑中8種成分的同時測定，也可為玉屏風制劑的質量控制及標準提高提供依據(jù)。
關鍵詞： 玉屏風制劑； 一測多評法； 相對校正因子； 高效液相色譜
“玉屏風”方是由黃芪、防風、白術(炒)組成的“扶正固表”經(jīng)典名方，具有益氣、固表、止汗的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明該方在調節(jié)機體免疫力、抗炎等方面表現(xiàn)突出，在預防和臨床治療中其加減方多為核心處方[1?4]。近年來，玉屏風制劑臨床多用于小兒咳嗽、哮喘、鼻炎、蕁麻疹、腎病等多種疾病的聯(lián)合治療[5?9]。目前關于玉屏風制劑的質量研究報道多集中在湯劑、散劑等醫(yī)院制劑上[10?12]，對于玉屏風中成藥的質量研究報道較少。玉屏風劑型中口服液、顆粒劑的質量標準形成年代已久，含量測定的指標主要為黃芪藥材中黃芪甲苷物質，其測定過程中樣品處理復雜，耗時長，對試驗人員操作要求高，且使用單味藥材中的單一成分評價制劑的質量具有局限性，已無法滿足現(xiàn)今的藥品質量評價需求。近些年玉屏風劑的質量研究方法已向多種物質含量同時測定的方向發(fā)展[13?15]，但筆者在測定過程中發(fā)現(xiàn)多種對照品混合溶液配制過程復雜、耗時，部分對照品存在購買昂貴、保存困難的問題，且使用多波長、波長切換技術檢測對儀器配置參數(shù)要求高，增加了檢測方法的難度。一測多評(QAMS)法是利用有效成分內在的函數(shù)關系和比例關系，通過只測定一個內參物實現(xiàn)多個成分的同步測定的方法。因其“整體、多維、全面”的優(yōu)勢已廣泛應用于中藥材及中藥制劑多指標成分分析和質量評價體系中[16?20]，解決了對照品緊缺和檢測成本高的問題。自2006年提出以來，該方法在《中華人民共和國藥典》2015版和2020版中得到了應用。玉屏風制劑中的5-O-甲基維斯阿米醇苷是防風藥材質量評價的指標物質，其色譜信息穩(wěn)定，價廉且容易獲得，結合目前多物質同時測定存在的問題，筆者以5-O-甲基維斯阿米醇為內參物，選擇涵蓋玉屏風制劑中黃芪、防風、白術(炒) 3味藥材的指標物質為檢測目標物，建立測定玉屏風劑中升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮8種成分含量的QAMS方法，以期為玉屏風制劑的質量控制及標準提供依據(jù)和參考。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀： (1) 1260 Infinity Ⅱ型，配二極管陣列檢測器(DAD)，安捷倫科技(中國)有限公司；(2) XR-20AD型，配PAD檢測器，日本島津儀器有限公司； (3) Ultimate 3000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
電子天平：XPE-205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。
超聲清洗儀：KH5200DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。
超純水系統(tǒng)：Milli-Q direct 16型，美國密理博公司。
乙腈：色譜純，德國默克公司。
甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷、白術內酯Ⅲ對照品：純度(質量分數(shù))分別為96.2%、97.6%、100%、97.4%、100%、99.9%，批號分別為111522-201712、111920-201606、111710-200602、111523-20181、111714-200501、111978-201501，中國食品藥品檢定研究院。
蒼術酮、芒柄花素對照品：純度(質量分數(shù))均為98.0%，批號分別為DST90607-107、DST91202-011，德思特生物技術有限公司。
玉屏風制劑樣品：共計18批(6個劑型)，依據(jù)《中華人民共和國藥典》(口服液、膠囊、顆粒、袋泡茶)、《衛(wèi)生部藥品標準 中藥成方制劑(第一冊)》(丸)、《國家藥品標準新藥轉正標準 第83冊》(滴丸)進行檢測，均為合格樣品。樣品詳情見表1。
表1 18批樣品信息
Tab. 1 Information of 18 batches of samples
1.2 色譜條件
色譜柱：Eclipse Plus C18柱[150 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]；流動相：乙腈(B)-水(A)，流量為1.1 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～15 min時B相體積分數(shù)由9%逐漸增加至30%，15～30 min時B相體積分數(shù)由30%逐漸增加至90%，35～36 min時B相體積分數(shù)由90%逐漸減少至9%，36～40 min時B相體積分數(shù)為9%；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL。
1.3 溶液配制
混合對照品溶液：分別精密稱取升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮對照品適量于不同容量瓶中，加入80%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶液稀釋，配制成8種成分的質量濃度分別為1 067、1 109、1 249、1 154、1 484、1 116、804、506 μg/mL的對照品儲備溶液。分別吸取上述對照品儲備溶液適量，置于同一只容量瓶中，加入80%甲醇溶液稀釋，得到8種成分的質量濃度分別為53.35、55.45、62.45、57.70、74.20、55.80、40.20、50.60 μg/mL的混合對照品溶液。
系列混合對照品工作溶液：精密吸取混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分別置于6只10 mL容量瓶中，各加入80%甲醇溶液稀釋至標線，搖勻，得到系列質量濃度的混合對照品工作溶液。
1.4 樣品處理
取顆粒、滴丸、膠囊、袋泡茶樣品內容物研細，精密稱取藥品粉末0.5 g，置于150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷卻至室溫，加入80%甲醇溶液補足減失質量，搖勻，吸取上清液過0.22 μm微孔有機濾膜，濾液即為樣品溶液。丸劑、口服液樣品溶液制備方法參照文獻[14?15]。
1.5 實驗方法
在1.2色譜條件下，分別測定系列混合對照品工作溶液和樣品溶液，記錄色譜峰面積，利用外標法計算樣品中8種成分的含量。
2. 結果與討論
2.1 專屬性試驗
按照1.2色譜條件，分別對混合對照品溶液和樣品溶液進行測定，結果如圖1所示。由圖1可以看出，樣品溶液和對照品溶液色譜峰的保留時間相匹配，無基質干擾，8種成分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計，均大于4 683，表明其專屬性良好。
圖1 混合對照品溶液和樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatograms of mixed reference solution and sample solution
1—升麻素苷； 2—毛蕊花糖葡萄糖苷； 3—升麻素； ；4—5-O-甲基維斯阿米醇苷； 5—亥茅酚苷； ；6—芒柄花素； 7—白術內酯Ⅲ； 8—蒼術酮
2.2 線性方程與檢出限
按照1.2色譜條件，分別對系列混合對照品工作溶液進行測定，以色譜峰面積為縱坐標(y)、溶液的質量濃度為橫坐標(x)，繪制標準工作曲線，計算線性方程及相關系數(shù)。取混合對照品溶液，用80%甲醇溶液逐級稀釋，分別以3倍信噪比和10倍信噪比時對應的溶液中目標物的質量濃度作為方法檢出限和定量限。8種成分的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限見表2。
表2 8種成分的質量濃度線性范圍、線性方程、檢出限及定量限
Tab. 2 Linear ranges of mass concentration，linear equations，detection limits and quantification limits of 8 chemical components
由表2可知，8種成分在相應質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均不小于0.999 6。
2.3 精密度試驗
按1.4方法平行制備S3、S5、S10、S11、S12、S15樣品溶液各6份，在1.2色譜條件下分別進樣測定，計算8種成分的質量分數(shù)，同時計算測定結果的相對標準偏差(RSD)，結果見表3。由表3可知，RSD為0.57%～1.62%，表明該方法精密度良好。
表3 精密度試驗測定結果的相對標準偏差(n=6)
Tab. 3 Relative standard deviation of determination results of precision test (n=6) ( % )
2.4 穩(wěn)定性試驗
取2.3中S3、S5、S10、S11、S12、S15樣品溶液各1份，分別于第0，6，12，20，30，40，48 h進樣測定8種成分的質量分數(shù)，同時計算測定結果的RSD，結果見表4。由表4可知，RSD為0.36%～1.32%，表明樣品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。
表4 穩(wěn)定性試驗測定結果的相對標準偏差(n=6)
Tab. 4 Relative standard deviation of determination results of stability test(n=6) ( % )
2.5 加標回收率試驗
選擇已知含量的6個劑型樣品S3、S5、S10、S11、S12、S15，按照樣品中8種成分含量100%的水平精密加入混合對照品溶液，分別平行制備6份加標樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，計算加標回收率，結果見表5。由表5可知，樣品加標平均回收率范圍91.7%～102.1%，表明該方法準確度良好。
表5 樣品加標回收試驗各目標物的回收率 (n=6)
Tab. 5 Recoveries of each target substance in samples spiked recovery test (n=6) ( % )
2.6 一測多評法的建立
2.6.1 內參物的選擇
5-O-甲基維斯阿米醇苷在制劑中含量適中，色譜信息穩(wěn)定，價廉且容易獲得，且出峰時間在色譜分析時間的中間部位，可以減少計算相對保留時間時的系統(tǒng)誤差。結合二極管陣列檢測器(DAD)光譜圖輔助鑒別，可以準確地對其他成分進行定位，因此選定5-O-甲基維斯阿米醇苷為內參物。
2.6.2 相對校正因子建立
采用標準曲線斜率法和濃度校正法，以5-O-甲基維斯阿米醇苷為內參物，計算升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮7種成分相對于5-O-甲基維斯阿米醇苷的校正因子，結果見表6。由表6可知，不過原點的標準曲線斜率法(相對校正因子為fa )、過原點的標準曲線斜率法(相對校正因子為fb)以及濃度校正法(相對校正因子為fc ) 3種方法校正因子的RSD為0.71%～2.15%。考慮到過原點的標準曲線斜率法可以減少誤差，選擇通過原點的標準曲線斜率法計算相對校正因子。
表6 標準曲線斜率法及濃度校正法建立的相對校正因子(n=3)
Tab. 6 Relative correction factors established by standard curve slope method and concentration correction method (n=3)
注： 1） fa為不過原點標準曲線斜率法的相對校正因子； 2） fb為過原點標準曲線斜率法的相對校正因子； 3） fc為濃度校正法的相對校正因子。
2.6.3 相對校正因子的耐用性
分別考察不同儀器、不同色譜柱、不同柱溫、不同流量對相對校正因子的影響， f1～f7分別為不同條件下升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮相對于5-O-甲基維斯阿米醇苷的校正因子，計算結果見表7～表9。由表7～表9數(shù)據(jù)計算得不同儀器和色譜柱條件下f1～f7的RSD分別為2.34%、3.75%、4.23%、2.56%、1.70%、4.26%、2.13%，不同柱溫條件下f1～f7的RSD分別為0.35%、0.30%、3.25%、1.26%、1.29%、2.19%、1.75%，不同流量條件下f1～f7的RSD分別為3.93%、1.22%、4.10%、4.45%、4.29%、3.58%、4.50%。表明不同條件對各目標化合物相對校正因子影響較小。
表7 不同儀器和色譜柱時的相對校正因子
Tab. 7 Relative correction factors for different instruments and chromatographic columns
表8 不同柱溫時的相對校正因子
Tab. 8 Relative correction factors at different column temperatures
表9 不同流量時的相對校正因子
Tab. 9 Relative correction factors at different volume flow rates
2.6.4 待測組分色譜峰的定位
色譜峰的準確定位是一測多評法應用的前提。以5-O-甲基維斯阿米醇苷的保留時間為定位標準，考察玉屏風系類制劑中其他7種成分在不同色譜柱、不同儀器上的相對保留時間。t1～t7分別為升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、亥茅酚苷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮相對于5-O-甲基維斯阿米醇苷的保留時間，結果見表10。由表10數(shù)據(jù)計算得各成分相對保留時間的RSD分別為4.77%、4.87%、2.66%、3.60%、4.39%、3.45%、4.50%，表明采用待測成分與內參物5-O-甲基維斯阿米醇苷的相對保留時間作為各組分定位的方法科學可行。
表10 不同儀器和色譜柱時的相對保留時間
Tab. 10 Relative retention time for different instruments and chromatographic columns
2.7 一測多評法與外標法結果比較
為驗證所建立的QAMS法的準確性及可行性，分別采用外標法(ESM)和QAMS法測定18批樣品中8種成分的含量。每批樣品制備2份溶液，各平行測定2次，以平均值作為測定結果，結果見表11。由表11可知，兩種方法的測定結果無顯著性差異(p＞0.05)，表明所建立的QAMS法結果準確，可以替代ESM法用于玉屏風制劑中8種成分的測定。
表11 ESM與QAMS法測定結果1）
Tab. 11 Determination results of ESM and QAMS methods
注：1）S1～S4為液體制劑，測定結果單位為mg/mL， S5～S18為固體制劑測定，測定結果單位為mg/g。
3. 結語
選用制劑中含量適中、色譜信息穩(wěn)定、價廉且易得的5-O-甲基維斯阿米醇苷為內參物，可降低檢測成本，提升檢測效率，且QAMS方法與ESM法的測定結果無差異。建立的QAMS方法便捷、準確、重現(xiàn)性好。由測定結果可知，不同劑型間8種化合物的含量差異和質量一致性差異均較大。排除原料藥材的差異因素，結合其生產(chǎn)工藝，推測生產(chǎn)過程中水提液的濃縮和醇沉中醇含量會影響制劑質量，應規(guī)范玉屏風制劑的水提醇沉過程的工藝參數(shù)。該方法可為玉屏風制劑多成分同時測定提供新的技術思路，還可為玉屏風制劑的質量標準提升提供數(shù)據(jù)參考。
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來源：化學分析計量
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