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生物胺是一類含氮的低相對分子質(zhì)量且具有生物活性的堿性有機胺類化合物，由對應(yīng)的氨基酸通過生物作用脫羧形成，也可通過醛類、酮類有機物在氨基酸轉(zhuǎn)氨酶作用下產(chǎn)生。生物胺主要存在各類食品（如乳制品、飲料、魚類水產(chǎn)品以及葡萄酒、黃酒等發(fā)酵食品）中，是生命體內(nèi)的活性成分，具有一定的生理功能，對內(nèi)臟功能和免疫系統(tǒng)的代謝過程有非常重要的作用，但攝入過多會引起頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應(yīng)，嚴重的還會損害人體神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，甚至危及生命。

 

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原材料，經(jīng)發(fā)酵釀制而成，發(fā)酵釀制酒中生物胺的含量隨著原料品種、國度、氣候、產(chǎn)區(qū)和釀造工藝等變化。經(jīng)發(fā)酵后的葡萄酒可能會有單寧帶來的粗糙、苦澀以及酸類物質(zhì)帶來的刺激口感，因此需要通過一段時間的陳釀來改善品質(zhì)。黃酒是以稻米、小麥等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵等工藝勾兌而成的飲料酒，黃酒中生物胺含量與乳酸菌、酸度、溫度等密切相關(guān)。乙醇會加強生物胺的毒性，因此生物胺在酒類中的限量標準要嚴于其他產(chǎn)品。我國制定了水產(chǎn)品高組胺魚類中HIS限 量 值 為 400mg·kg−1，其他魚類中HIS限量值為200mg·kg−1，對于酒類暫未制定相應(yīng)標準限量值，但文獻報道白酒和黃酒中均檢出生物胺。生物胺分布廣，含量波動范圍大，隨著人民生活水平的不斷提高，對食品研究的不斷深入，全世界將會更加詳細制定各食品類中生物胺的限量標準，以保障人類生命健康安全。

 

目前已有很多生物胺的檢測方法，如液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、超高效液相色譜法等，在 GB 5009.208— 2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中僅涉及液相色譜法和分光光度法，其操作繁瑣，檢測時間長，且不涉及氣相色譜法。由于生物胺揮發(fā)性不強，不易氣化，需要將生物胺轉(zhuǎn)化成氨基甲酸酯類化合物以便分析。基于此，研究人員采用分散液液微萃取技術(shù)進行前處理，以氯甲酸異丁酯為衍生試劑，提出了氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定葡萄酒和黃酒中7種生物胺 [2-苯乙胺（2-PEA）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、HIS、色胺（TRY）、酪胺（TYR）、章魚胺（OA）]含量的方法。

 

1.試驗方法

 

取葡萄酒或黃酒樣品，加入內(nèi)標溶液、飽和碳酸氫鈉溶液（維持樣品溶液pH在9.5~10.0內(nèi)）和PVPP，渦旋凈化，離心后取上清液，加入衍生試劑氯甲酸異丁酯，室溫渦旋反應(yīng)。加入乙醇、二氯甲烷，進一步渦旋提取，離心后取下層二氯甲烷提取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后按照儀器工作條件測定。

 

2.結(jié)果與討論

 

2.1 色譜行為

 

生物胺本身不容易氣化，但伯胺、仲胺可以與氯甲酸異丁酯發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成的氨基甲酸酯衍生物容易氣化。5mg·L−1混合標準溶液中各單生物胺衍生物的總離子流色譜圖見圖1。

 

由圖1可知，7種生物胺的衍生物在DB-5MS毛細管色譜柱上分離較好。

 

2.2 特征離子的選擇

 

對衍生物質(zhì)譜進行解析，以確保獲得的特征離子是目標化合物衍生產(chǎn)物的。以HIS為例，其衍生物通過質(zhì)譜分析得到以下碎片離子m/z 311，238，194，182，138，94，82，57，如圖2所示。

 

由圖2可知，m/z 311為HIS衍生物的分子離子 [M]+，m/z 194為分子離子失去氨基甲酸異丁酯形成的碎片離子[M-117]+，而m/z 182，138，94，82，57是碎片離子[M-117]+進一步分解形成的子碎片離子，選取其中m/z 311，194，182這3個非色譜柱流失離子為HIS的特征離子，其中m/z 194為定量離子。HIS衍生產(chǎn)物碎片離子的解析見圖3。

 

 

2.3 衍生時溶液酸度的選擇

 

分別向6組12支錐形試管準確加入 50mg·L−1混合標準溶液100μL，加入 50mg·L−1內(nèi)標溶液100μL，每一組加入不同酸度（pH分別為9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，12.0）的緩沖溶液200μL，混勻，分別加入50μL氯甲酸異丁酯進行衍生，渦旋混勻5min，向錐形試管中加入500μL乙酸乙酯提取，渦旋提取后離心，吸取上層乙酸乙酯提取液上機檢測。結(jié)果顯示，衍生時溶液pH在9.5~10.0時檢測響應(yīng)值較高且穩(wěn)定，因此試驗選擇飽和碳酸氫鈉溶液來調(diào)節(jié)樣品溶液的pH，使 pH維持在9.5~10.0內(nèi)。

 

2.4 凈化及萃取條件的選擇

 

酒中可能包含脂溶性雜質(zhì)，會干擾試驗結(jié)果，考慮在分析前通過加入有機溶劑二氯甲烷或乙酸乙酯除去部分脂溶性雜質(zhì)。準確吸取3份50mg·L−1混合標準溶液100μL，加入50mg·L−1內(nèi)標溶液100μL，再加入300μL飽和碳酸氫鈉溶液，混勻，其中一份加入200μL二氯甲烷提取，另一份加入200μL乙酸乙酯，一份不做任何處理。渦旋提取后離心，棄去除雜液體，定容至1mL，加入氯甲酸異丁酯，渦旋提取，向溶液中加入乙酸乙酯，渦旋提取，離心 ，取乙酸乙酯提取液上機檢測。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，有機溶劑除雜效果不明顯，且回收率不滿足試驗要求。

 

PVPP是一種水溶性高分子化合物，既能溶于水，又溶于大部分有機溶劑，擁有良好的絡(luò)合能力，在食品、醫(yī)療行業(yè)常作為澄清劑、吸附劑等，可吸附酒中一些沉淀物而去除雜質(zhì)干擾。取3組試管，每組準確吸取 空白水樣，加入50mg·L−1混合標準溶液、50mg·L−1內(nèi)標溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和PVPP，渦旋混勻后離心，將液體全部轉(zhuǎn)移至新的錐形試管后采用 2.4節(jié)中上述方法繼續(xù)衍生分析。結(jié)果顯示，加入PVPP后，空白加標樣品中生物胺的回收率為86.6%~104%，相對標準偏差（RSD）為0.27%~5.0%，說明加入PVPP不會干擾測定結(jié)果。因此，試驗選擇在樣品中加入PVPP去除酒中色素、沉淀等雜質(zhì)。

 

另外，參考液液微萃取反應(yīng)條件，將提取時的乙酸乙酯試劑更改為衍生結(jié)束加入乙醇、二氯甲烷。試驗結(jié)果表明，使用二氯甲烷提取時生物胺衍生物的響應(yīng)值優(yōu)于乙酸乙酯提取時的，因此試驗最終選擇以二氯甲烷為萃取劑。

 

2.5 標準曲線

 

取適量的50mg·L−1混合標準溶液，按照前述試驗方法衍生并處理，得到各生物胺的質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mg·L−1，內(nèi)標質(zhì)量濃度為5.0mg·L−1的混合標準溶液系列，并按照儀器工作條件測定，以生物胺與內(nèi)標的質(zhì)量比為橫坐標，以對應(yīng)生物胺衍生物與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明，各生物胺標準曲線的線性范圍均為0.2~10.0mg·L−1，線性回歸方程

 

和相關(guān)系數(shù)見表1。

 

表1 線性參數(shù)

2.6 檢出限、測定下限、精密度和回收試驗

 

分別對葡 萄 酒 和 黃 酒 樣 品 進 行0.5，2.0，5.0mg·L−1等3個濃度水平的加標回收試驗，計算回收率和測定值的RSD，結(jié)果見表2。若樣品中生物胺含量超出線性范圍，稀釋至合適質(zhì)量濃度再進行分析。

 

表2 精密度和回收試驗結(jié)果（n=6）

由表2可知，在葡萄酒和黃酒樣品中進行0.5，2.0，5.0mg·L−1濃度水平的加標后，各生物胺的回收率為83.3%~116%，測定值的RSD為0.70%~9.4%，說明方法完全可以滿足澳大利亞、德國等國家生物胺（HIS）限量規(guī)定要求（2~10mg·L−1）。當取1mL樣品時，確定本方法7種生物胺的測定下限均為0.2mg·kg−1，檢出限均為0.1mg·kg−1。

 

2.7 樣品分析

 

按照試驗方法測定7份酒樣（4份葡萄酒和3份黃酒）中7種生物胺的含量，結(jié)果見表3。若樣品中生物胺含量超出線性范圍，稀釋至合適質(zhì)量濃度再進行分析。

 

表3 樣品分析結(jié)果

根據(jù)澳大利亞法規(guī)要求，本次試驗抽檢的葡萄酒樣品中HIS未超過限量要求（10mg·L−1），黃酒中則超過該限量值。從本次檢測結(jié)果看，PUT和HIS在生物胺中含量最高，占總生物胺含量的1/2以上，甚至達總量的 89%，葡萄酒中生物胺含量水平的差異，可能是原材料、生產(chǎn)技術(shù)、儲藏方式等不同引起的。

 

3. 試驗結(jié)論

 

研究人員采用PVPP進行除雜，氯甲酸異丁酯進行衍生化，乙醇、二氯甲烷進行萃取，以氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定葡萄酒和黃酒中7 種生物胺的含量，方法簡便、快速、準確，滿足檢測要求。通過數(shù)據(jù)分析及文獻查閱發(fā)現(xiàn)酒中HIS在不同國家的限量值不同，雖然暫未超過澳大利亞等國家對HIS的限量要求，基于生物胺的毒性，我國也應(yīng)該出臺相關(guān)標準，加強釀制酒生產(chǎn)源頭、工藝流程的管理，以提升釀制酒質(zhì)量安全，保障人民的健康發(fā)展。

 

作者：周江平1，木玉仙1，和春映1，翟江舸1，趙永信2，吳平谷2

 

單位：1. 古城區(qū)疾病預(yù)防控制中心；

 

2. 浙江省疾病預(yù)防控制中心

 

來源：《理化檢驗-化學(xué)分冊》2025年第3期