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抗體藥物的結(jié)構(gòu)具有顯著的異質(zhì)性，正確的分子結(jié)構(gòu)是保證抗體藥物安全有效的物質(zhì)基礎(chǔ)。在質(zhì)量研究中，對抗體藥物進行全面的表征分析是進行質(zhì)量控制的重要手段。其中，純度作為抗體藥物的一項重要檢測指標，直接反映了抗體純化工藝的水平以及產(chǎn)品質(zhì)量的高低。

圖1 抗體藥物異質(zhì)性的原因及表征方法

大小異質(zhì)性一般分為三類，即單體、片段和多聚體。片段包括降解的單抗和組裝不完全的重輕鏈等，而多聚體則包括二聚體、寡聚體和更復(fù)雜的聚體等。多聚體不僅是單抗中的非活性成分，同時也是引發(fā)單抗免疫原性的關(guān)鍵因素之一，因此大小異質(zhì)性是單抗生產(chǎn)工藝優(yōu)化、生產(chǎn)過程控制及放行分析中不可或缺的檢測項目，也是評價單抗穩(wěn)定性的重要指標之一。

隨著技術(shù)的不斷進步，單抗大小異質(zhì)性的分析手段日益豐富。不同的分析技術(shù)基于不同的原理，能夠揭示單抗在大小異質(zhì)性方面的不同特性。其中，分子排阻色譜法（SEC-HPLC）和毛細管電泳法（CE-SDS）因相對簡單易行，已成為分析單抗類制品大小異質(zhì)性的兩種常用方法。本文主要闡述分子排阻色譜法的原理及注意事項。

分子排阻色譜法（Size Exclusion Chromatography，SEC），也被稱為空間排阻色譜或凝膠排阻色譜，是在20世紀60年代初發(fā)展起來的一項分析技術(shù)?！吨袊幍洹?005年版將此法收入藥典附錄中，此版藥典收載該法的藥品品種相對較少，不足20個。然而《中國藥典》2020年版收載該法的藥品已有近百種，其中二部收載了近80種藥品，該法主要用于抗生素聚合物的檢測、分離以及大分子物質(zhì)的分子量及分子量分布的測定。在三部中，該技術(shù)被應(yīng)用于重組乙型肝炎疫苗、胰島素等9個品種，主要用于高分子蛋白質(zhì)的檢查、蛋白聚合物的檢測等。此外，四部有16個原輔料品種也收載了此法，主要用于分子量分布的測定及大分子物質(zhì)的含量測定等。從藥典收載的變化情況來看，分子排阻色譜法的應(yīng)用日益增多。

原理

分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。其根據(jù)待測組分的性質(zhì)一般可以分為凝膠過濾色譜法-GFC( 采用水溶液或緩沖液作為流動相) 和凝膠滲透色譜法-GPC( 采用有機溶劑作為流動相) 。

色譜柱常用的填料有分子篩填料、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠和玻璃珠等，目前，基于凝膠的柱填料使用最為廣泛，藥品檢驗中常用的填料是葡聚糖凝膠 Sephadex G-10。填料表面分布著大小不同的孔徑, 藥物分子進入色譜柱后,不同組分按大小進入相應(yīng)的孔徑內(nèi)。分子量大于所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內(nèi)部，因此在色譜過程中最早被流動相洗脫至柱外，保留時間較短；分子量小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時間較長，保留時間較長；其余分子則按分子量大小依次被洗脫。

圖2 不同分子量的物質(zhì)分子排阻洗脫示意圖

注意事項

1.色譜柱不耐高壓。SEC的分離原理基于不同大小組分在填料中孔道路徑上的差異，因此SEC填料需要較大孔容積來確保分離效果?？兹莘e越大，有效“分離窗口”越寬，分離效果就越好。然而隨著填料的孔容積的增大，其機械強度也越差，因此相比常規(guī)的C18色譜柱，所裝填的SEC色譜柱的耐壓性較差。在使用SEC色譜柱時，建議逐步緩慢提升流速至實驗所需水平，降低色譜柱由于升壓過快導(dǎo)致柱床塌陷的風險。

2.當啟用一支全新的SEC色譜柱時，初期可能會觀察到第一針峰值的響應(yīng)較低。然而，隨著連續(xù)的進樣，信號響應(yīng)會逐漸增強并最終趨于穩(wěn)定。這種現(xiàn)象在生物大分子色譜分析中屢見不鮮，其主要原因是色譜柱的篩板、柱管和填料中含有一定數(shù)量的活性位點。這些活性位點具有吸附特定性質(zhì)生物大分子的能力。例如，在進行單抗聚體分析時，初始階段可能會發(fā)現(xiàn)聚體峰面積逐步增大，一旦所有未知的活性位點被蛋白質(zhì)完全屏蔽后，樣品中所有組分的峰面積就會達到穩(wěn)定狀態(tài)。

3.分子排阻色譜柱的體積通常較大，長度較長，和高效液相色譜儀聯(lián)用時，個別色譜柱無法順利安裝進柱溫箱，只能在室溫下進行樣品檢測，無法對柱溫進行有效的控制調(diào)節(jié)。

4.分子排阻色譜法通常采用水溶液或緩沖溶液作為流動相，這樣的環(huán)境容易滋長微生物，因此，在需要長時間使用的情況下，通常需要在流動相中加入抑菌劑以防止微生物的滋生。

5.在SEC的流動相中加入適當濃度的鹽（通常在50-100mM范圍內(nèi)），可以有效避免分析物與固定相之間的二級作用，進而改善色譜峰形。盡管鹽的濃度上限是1M，理論上更高濃度的鹽并不會損壞色譜柱，但隨著鹽濃度的升高，蛋白質(zhì)與固定相之間的疏水作用也會增強，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低，引起柱壓升高。因此，在實際應(yīng)用中，需要權(quán)衡鹽濃度對峰形改善和潛在副作用的影響，以選擇最佳的色譜條件。

6.在SEC的流動相中，需嚴格控制有機溶劑的比例。當有機溶劑的比例過高時，硅膠基質(zhì)的SEC柱的保留機理將逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镠ILIC，而不再完全取決于分析物的分子量。