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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-05-27 20:40
摘 要： 建立頂空氣相色譜-質(zhì)譜法測定交沙霉素及其制劑中遺傳毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺（NDMA）的含量。樣品采用二甲亞砜溶解，色譜柱為DB-WAX UI（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，載氣為高純氦氣，恒流模式，流量為1.0 mL/min，頂空平衡溫度為130 ℃，平衡時間為20 min。采用電子轟擊源（EI），電離能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式。NDMA在質(zhì)量濃度為2.467～49.330 ng/mL時與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，檢出限為4 ng/g。樣品加標(biāo)回收率為95.64%～117.50%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.3%（n=6）。初步分析NDMA來源于原料生產(chǎn)過程，提示原料生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注物料的質(zhì)量及工藝的優(yōu)化。該方法準(zhǔn)確靈敏、專屬性強(qiáng)，可用于交沙霉素及制劑中遺傳毒性雜質(zhì)NDMA的質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞： 交沙霉素； N-亞硝基二甲胺； 頂空氣相色譜-質(zhì)譜法； 遺傳毒性雜質(zhì)
N-亞硝基二甲胺(NDMA)屬于N-亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)，具有強(qiáng)致癌作用和明顯的肝毒性[1?2]。近年來，NDMA陸續(xù)在沙坦類藥物、雷尼替丁中檢出，嚴(yán)重影響了藥物的安全性。根據(jù)國際人類用藥技術(shù)要求協(xié)調(diào)會（ICH）發(fā)布的指導(dǎo)原則中對遺傳毒性雜質(zhì)的分類，亞硝胺類化合物屬于高效致突變致癌物(關(guān)注隊(duì)列)。亞硝胺類雜質(zhì)有多種來源，如工藝產(chǎn)生、降解途徑和污染引入等。有報道指出含有二甲胺官能團(tuán)的叔胺和季胺可以降解生成NDMA[3?4]。交沙霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有二甲胺的結(jié)構(gòu)，為保證該藥物的安全性，有必要對交沙霉素中的NDMA進(jìn)行分析和控制。目前，交沙霉素中的NDMA的檢測方法鮮見公開報道。
美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布的指導(dǎo)意見中，NDMA建議的可接受攝入量為96 ng/d。按交沙霉素每日最大用藥1.6 g計算，NDMA限度為60 ng/g，由于限度極低，要求測定方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高。目前藥物中NDMA測定方法主要采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法[5?8]，進(jìn)樣方式為液液萃取后直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[9?12]也是常用的方法，可避免藥物在高溫條件下發(fā)生降解導(dǎo)致的假陽性。
筆者參考文獻(xiàn)[8]，采用二甲亞砜為溶劑，通過優(yōu)化色譜條件、頂空平衡溫度和時間等，建立了靈敏度高、專屬性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確的頂空氣相色譜-質(zhì)譜(HS-GC-MS)法測定交沙霉素及其片劑中NDMA的含量，通過影響因素試驗(yàn)初步分析了NDMA的來源，可為交沙霉素及其片劑中亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的控制提供參考。
1. 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
頂空氣相色譜-質(zhì)譜儀：7890B-7000C型，美國安捷倫科技有限公司。
電子天平：CPA2250 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
高速冷凍離心機(jī)：UNIVERSAL 302R型，德國Hettich公司。
甲醇、二甲亞砜：均為色譜純，德國默克公司。
N-亞硝基二甲胺對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號為510166-202104，中國食品藥品檢定研究院。
交沙霉素片：規(guī)格0.2 g，批號分別為JN191102、JN200102、JN200204、JN220103、JN230303，A企業(yè)。
交沙霉素：批號分別為R220801006、R220801007、R220801008、R220801009，B企業(yè)，為A企業(yè)制劑使用的原料。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 頂空進(jìn)樣器
頂空平衡溫度：130 ℃；平衡時間：20 min；傳輸線溫度：135 ℃；進(jìn)樣時間：2 min。
1.2.2 色譜條件
色譜柱：DB-WAX UI毛細(xì)管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；載氣：高純氦氣；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為2∶1；升溫程序：起始溫度為40 ℃，維持0.5 min，以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，再以60 ℃/min的速率升溫至240 ℃，維持4.5 min。
1.2.3 質(zhì)譜條件
電離方式：電子轟擊電離源(EI)；數(shù)據(jù)掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；電離能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；定量離子：質(zhì)荷比為74，44，碰撞能量為5 eV；定性離子：質(zhì)荷比為74，42，碰撞能量為18 eV。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 溶液的制備
空白溶液：二甲亞砜。
NDMA對照品儲備液：質(zhì)量濃度為500 ng/mL。取NDMA對照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，精密量取0.1 mL于200 mL量瓶，加二甲亞砜稀釋至標(biāo)線。
NDMA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取NDMA對照品儲備液適量，用二甲亞砜稀釋制成NDMA質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL于20 mL頂空瓶中，密封。
交沙霉素樣品溶液：取交沙霉素約0.32 g，精密稱定，置于20 mL頂空瓶中，精密加入二甲亞砜2 mL，密封。
交沙霉素片樣品溶液：取交沙霉素片20片，精密稱定，研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉適量(相當(dāng)于交沙霉素0.8 g)，精密稱定，置于50 mL塑料離心管中，精密加入二甲亞砜5 mL，渦旋2 min，置于高速冷凍離心機(jī)中離心10 min (轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，溫度為5 ℃)，精密量取上清液2 mL置于20 mL頂空瓶中，密封。
1.3.2 樣品測定
取交沙霉素樣品溶液、交沙霉素片樣品溶液上機(jī)測定，以保留時間和碎片離子豐度比定性，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。
2. 結(jié)果與討論
2.1 檢測方法和進(jìn)樣方式的選擇
目前采用液相色譜法測定藥物中NDMA的樣品處理方式多為采用有機(jī)溶劑溶解藥物后直接進(jìn)樣分析，因NDMA限度極低，為了使分析方法的靈敏度滿足檢測要求，通常需配制較高濃度的樣品溶液，大量的藥物進(jìn)入色譜系統(tǒng)會影響方法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。筆者采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合頂空進(jìn)樣方式分析NDMA，可避免大量藥物進(jìn)入色譜系統(tǒng)，減少色譜系統(tǒng)的污染，保證方法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。
2.2 色譜條件及頂空平衡溫度、平衡時間的選擇
考察DB-WAX UI、DB-624和HP-5MS UI 3種不同填料的毛細(xì)管柱對NDMA測定的影響，結(jié)果表明，采用DB-WAX UI分析色譜柱時目標(biāo)分析物的峰形最好?？疾觳煌V柱流量(1.0、1.5、2.0 mL/min)時NDMA的出峰情況，當(dāng)柱流量為1.5和2.0 mL/min時，NDMA與干擾峰分離度達(dá)不到要求，因此選擇柱流量為1.0 mL/min。
考察不同平衡溫度(90、110、120、130、140 ℃)平衡20 min對NDMA響應(yīng)值的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，響應(yīng)值變大，但是考慮到平衡溫度過高有可能導(dǎo)致NDMA不穩(wěn)定，因此選擇平衡溫度為130 ℃。同時考察了在130 ℃下不同平衡時間(10、15、20、25 min)對NDMA響應(yīng)值的影響，發(fā)現(xiàn)在20 min時響應(yīng)值已達(dá)到最大，因此選擇平衡時間為20 min。
2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化
在正離子模式下對NDMA進(jìn)行母離子全掃描，再對其子離子進(jìn)行全掃描，以各子離子的色譜峰峰高為指標(biāo)，對碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化選擇。選擇兩個豐度最高的特征離子作為定性離子，并以其中豐度較高的子離子作為定量離子。
2.4 專屬性試驗(yàn)
取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)及交沙霉素片樣品溶液進(jìn)樣分析并記錄色譜圖，見圖1。由圖1可見，空白溶液在NDMA保留時間相同位置處無干擾峰，表明方法專屬性良好。
圖1 NDMA測定的典型色譜圖
Fig. 1 Typical chromatogram of NDMA
2.5 線性關(guān)系考察
取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。NDMA在質(zhì)量濃度2.467～49.330 ng/mL內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝662.8x+281.5，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。
2.6 檢出限和定量限
精密量取質(zhì)量濃度為5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用二甲亞砜逐級稀釋并檢測，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限。定量限為12 ng/g (按交沙霉素標(biāo)示量計算)，檢出限為4 ng/g (按交沙霉素標(biāo)示量計算)。
2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)
取批號為JN230303的交沙霉素片細(xì)粉適量(相當(dāng)于交沙霉素0.8 g)，精密稱定，置于50 mL塑料離心管中，分別精密加入質(zhì)量濃度為50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、二甲亞砜4 mL，渦旋2 min，置于高速冷凍離心機(jī)中離心10 min (轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，溫度為5 ℃)，精密量取上清液2 mL至20 mL頂空瓶中，密封，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，根據(jù)NDMA峰面積計算回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表1。由表1可知，NDMA回收率為95.64%～117.50%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.3%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均良好，滿足分析要求。
表1 加標(biāo)回收驗(yàn)結(jié)果(n=6)
Tab. 1 Results of standard addition recovery test (n=6)
2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
取批號JN230303的交沙霉素片細(xì)粉適量(相當(dāng)于交沙霉素3.2 g)，精密稱定，置于50 mL塑料離心管中，分別精密加入質(zhì)量濃度為50 ng/mL的NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL、二甲亞砜16 mL，渦旋2 min，置于高速冷凍離心機(jī)中離心10 min (轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，溫度為5 ℃)，分別精密量取上清液2 mL置于5只不同的20 mL頂空瓶中，密封，室溫條件下放置，分別于第0、2、5、8、10 h進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計算峰面積平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。由表2可知，NDMA色譜峰面積的RSD為2.0%，表明被測物在10 h內(nèi)穩(wěn)定。
表2 NDMA溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 2 NDMA solution stability test results
2.9 影響因素試驗(yàn)
取交沙霉素片(批號JN230303)和交沙霉素(批號R220801009)，分別在高溫(50 ℃)、高濕(溫度25 ℃，相對濕度95%)與強(qiáng)光照射(4 500 Lx) 3種條件下分別放置5、10 d。按照試驗(yàn)方法，制備樣品溶液并進(jìn)樣分析，結(jié)果在3種條件下分別放置5 d及10 d的樣品中NDMA含量與0 d相比基本無變化。
2.10 NDMA來源分析
交沙霉素及交沙霉素片在高溫、高濕與強(qiáng)光照射條件下放置5、10 d后，NDMA含量均未增加，表明交沙霉素及其制劑在儲存過程中不產(chǎn)生NDMA。此次試驗(yàn)未能收集到交沙霉素片的輔料，而交沙霉素片中NDMA檢出量與交沙霉素原料接近，因此推測交沙霉素中的NDMA為生產(chǎn)過程中物料引入或工藝雜質(zhì)，而制劑中NDMA主要來源于原料，提示原料生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注原料生產(chǎn)過程中使用的物料的質(zhì)量及工藝的優(yōu)化。
3. 結(jié)語
建立頂空氣相色譜-質(zhì)譜法測定交沙霉素及其制劑中N-亞硝基二甲胺的含量。該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可準(zhǔn)確測定N-亞硝基二甲胺的含量，可為交沙霉素及其制劑中亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的控制提供參考。
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引用本文： 鄧鳴，曾慶花，梁秋霞，等 . 頂空氣相色譜-質(zhì)譜法測定交沙霉素及其制劑中N-亞硝基二甲胺［J］. 化學(xué)分析計量，2025，34（2）： 8. (DENG Ming, ZENG Qinghua, LIANG Qiuxia, et al. Determination of N-nitrosodimethylamine in josamycin and its preparations by headspace gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(2): 8.)
來源：化學(xué)分析計量
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