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一、項(xiàng)目介紹

 

體外條件下，用于測定抗菌藥物或材料體外抑制細(xì)菌生長效力的試驗(yàn)稱為抑菌試驗(yàn)。通過抑菌試驗(yàn)，可以測定一個(gè)藥物或材料的最低抑菌濃度，用以評(píng)價(jià)該藥物或材料的抑菌性能，這是抗菌藥物的最基本的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。主要方法：平板涂布計(jì)數(shù)、抑菌圈測試、OD值測試、MIC/MBC等。

 

1、平板涂布計(jì)數(shù)簡介

 

將待測樣品與菌液共培養(yǎng)后，取一定量的稀釋樣液涂布到平板上，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞；統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。通過與組內(nèi)或者組間比較，從而得到樣品對(duì)測試菌株的抗菌性能。

 

 

 

參照標(biāo)準(zhǔn) ：

 

GBT 31402-2015 塑料 塑料表面抗菌性能試驗(yàn)方法

 

JCT 1054-2007 鍍膜抗菌玻璃

 

GBT 20944.3-2008 紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià) 第3部分震蕩法

 

GBT 21510-2008 納米無機(jī)材料抗菌性能檢測方法

 

GB/T 23763-2009  光催化抗菌材料及制品抗菌性能的評(píng)

 

2、抑菌圈測試簡介

 

抑菌圈法是衡量殺菌防霉劑效果的一種方式，主要用于測定殺菌防霉劑對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。通過殺菌防霉劑在瓊脂平板上的擴(kuò)散能力來初步篩選更有效的殺菌防霉劑品種。主要方法：K-B法（Kirby-Bauer test）、打孔、牛津杯。

 

 

參照標(biāo)準(zhǔn)：

 

GB/T 39101-2020 多肽抗菌性測定 抑菌圈法

 

3、OD值測試

 

待測樣品與菌液共培養(yǎng)后，細(xì)菌生長的培養(yǎng)液濁度與細(xì)菌濃度成正比，通過測試培養(yǎng)液的OD值來表征待測材料的抗菌效果。

 

 

4、MIC/MBC

 

最低抑菌濃度（MIC）：能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低藥物濃度；最小殺菌濃度（MBC）：能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低藥物濃度，殺死99.9%的供試微生物所需的最低藥物濃度。MIC和MBC都可用來評(píng)價(jià)藥物抑菌或者殺菌作用的強(qiáng)弱，數(shù)值越小，藥物的作用越強(qiáng)。

 

 

參照標(biāo)準(zhǔn)：

 

GB/T27623.1-2011 漁用抗菌藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范 第1部分:常量肉湯稀釋法 藥物敏感性試驗(yàn)

 

YY/T 0688.1-2008臨床實(shí)驗(yàn)室檢測和體外診斷系統(tǒng)　感染病原體敏感性試驗(yàn)與抗菌劑敏感性試驗(yàn)設(shè)備的性能評(píng)價(jià)

 

二、樣品要求

 

1、平板涂布計(jì)數(shù)

 

a.塊體類：薄膜、金屬塊、鍍膜玻璃等（具備一定的表面積）。送樣量：樣本量為1個(gè)/次重復(fù)/種菌。樣本尺寸：要求測試面積大于等于1.5×1.5cm，大于該面積按照比例添加菌液。

 

b.液體類：送樣量根據(jù)測試時(shí)樣本的溶劑和濃度而定，濃度由樣品特性及實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，需要客戶確定，一般不超過500ul（5ml菌液的10%）。

 

c.粉末類：送樣量：需要提供樣本與菌液的培養(yǎng)體系，比如X g樣本/mL菌液，樣本量為X g/次重復(fù)/種菌。若無相關(guān)參考，一般可提供5mg，用5ml菌液孵育24h，進(jìn)行嘗試。

 

2、抗菌圈測試

 

a.塊體類：薄膜、布料、金屬塊、紙片、凝膠等

 

制樣要求：金屬塊、凝膠類樣本須制備成統(tǒng)一大小的圓形/方形，建議制備直徑為6 mm圓形。布料、紙片類樣本可代為裁剪，默認(rèn)制備直徑為6 mm。若樣品太脆無法裁剪，可稱取相應(yīng)質(zhì)量（一般100mg）材料，用1mlPBS浸泡12h，制備成藥敏片，進(jìn)行嘗試，也可根據(jù)具體情況定制。

 

注：凝膠樣本須保證樣本在培養(yǎng)條件下（一般為37℃）不融化。

 

b.液體類：（需制備藥敏片）

 

送樣量：根據(jù)測試時(shí)樣本濃度而定，一般為1 mL/種菌，如需稀釋請(qǐng)告知稀釋倍數(shù)，濃度若無相關(guān)參考，一般可采用1mg/ml 進(jìn)行嘗試。

 

c.粉末類：（需打孔）

 

打孔器打6 mm直徑的孔，原則上需要粉末填充充滿所打的孔，一般最少需要1g粉末樣品。建議制作分散液，按照等體積加樣(每個(gè)孔最大加樣量為0.2 mL)。

 

3、OD值測試

 

a.塊體類：薄膜、布料、金屬塊、紙片、凝膠等。送樣量：由樣品特性及實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，需要提供樣本與菌液的培養(yǎng)體系。若無相關(guān)參考，一般采用96孔法，每個(gè)樣品需要提供3mg進(jìn)行嘗試。

 

b.液體類（要求樣本溶液無色或者淡色）。由樣品特性及實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ枰蛻舸_定，一般采用96孔法，若無相關(guān)參考，每個(gè)樣品需要提供200ul，母液濃度一般1mg/ml，進(jìn)行嘗試。

 

4、MIC/MBC

 

粉末/液體類（要求樣本溶液，完全溶解且無色或者淡色）-微孔板法 ；提供的粉末必須可溶，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，最大母液濃度512ug/ml，如果不參照標(biāo)準(zhǔn)，則可自行定濃度。

 

三、結(jié)果展示

 

1、平板涂布計(jì)數(shù)

 

默認(rèn)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，結(jié)果為三個(gè)計(jì)數(shù)（含照片）和平均值。以大腸桿菌為例：

 

 

對(duì)照組

 

樣品1

 

2、抗菌圈測試

 

結(jié)果反饋三個(gè)平板帶抑菌圈和測量的抑菌圈，每個(gè)抑菌圈測量三次取平均值。

 

 

3、OD值測試

 

默認(rèn)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，即每個(gè)點(diǎn)交付3次OD值。

 

 

 

4、MIC

 

MIC結(jié)果為肉眼可見無細(xì)菌生長的最小濃度，默認(rèn)三個(gè)重復(fù)（拍照一次），最終告知哪個(gè)濃度無細(xì)菌生長（如下表），也可掃OD 。

 

(注意：樣品有顏色，OD值顯示不準(zhǔn)確，不建議掃OD)

 

 

注：-表示無細(xì)菌生長，+表示有細(xì)菌生長。

 

由測試結(jié)果可知，樣品A的MIC為16μg/ml，對(duì)照諾氟沙星的MIC為2μg/ml，樣品A的MBC為32μg/ml。

 

四、常見問題

 

1、培養(yǎng)基配置應(yīng)注意的問題

 

1）滅菌溫度要嚴(yán)格控制，按照要求滅菌，尤其含糖量較高的培養(yǎng)基溫度不應(yīng)太高，過高會(huì)導(dǎo)致糖分焦化，影響質(zhì)量。

 

2)瓊脂培養(yǎng)基不能反復(fù)溶化。反復(fù)溶化會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。

 

3)培養(yǎng)基不能反復(fù)滅菌，反復(fù)滅菌也會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分的破壞。

 

4)含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌后，要搖勻。

 

2、常規(guī)菌株需要設(shè)置抗生素對(duì)照組嗎？

 

一般菌株為常規(guī)菌株，不耐藥，做抗生素對(duì)照意義不大。

 

3、液體樣品溶劑需要注意哪些？

 

溶劑為DMSO的液體樣本，需注意純的DMSO會(huì)殺菌的，建議溶劑DMSO低于5%，并做陰性對(duì)照。