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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-05-30 16:40
通過對藥品檢驗潔凈室中常用的消毒劑進行效能驗證，進而控制潛在的微生物污染風險。本研究采用懸液定量殺滅試驗法，利用已知的標準菌株及從潔凈區(qū)采集的已鑒定環(huán)境菌，對甲酚皂、新潔爾滅、75%乙醇和殺孢子劑等4種常見消毒劑的殺菌效果進行快速評估。結(jié)果顯示，在各種消毒劑對菌株的殺滅效果中，當作用時間不同時，會呈現(xiàn)出顯著的差異。75%乙醇和甲酚皂在作用時間較短時，對大多數(shù)細菌營養(yǎng)體殺滅對數(shù)值小于5，在延長作用時間后，效果有顯著提高。新潔爾滅及殺孢子劑的殺菌效果在短時間內(nèi)效果較好，尤其是對于葡萄球菌屬和微球菌屬，而芽孢對于各類消毒的敏感性均較低。在最長作用時間下，各消毒劑對營養(yǎng)體、芽孢及霉菌孢子的殺滅對數(shù)值均大于5。多種類的環(huán)境菌株更能全面反映潔凈環(huán)境中真實的微生物污染狀況，更有利于篩選合適消毒劑，進而為藥品微生物檢驗機構(gòu)及企業(yè)制定合理且有效的消毒程序提供依據(jù)。
藥品微生物潔凈室是指專用于藥品微生物檢驗的潔凈實驗室、隔離系統(tǒng)及其他受控環(huán)境，其潔凈程度直接關(guān)系到藥品檢測結(jié)果的準確性。 因此，定期對潔凈實驗室進行清潔消毒和微生物監(jiān)控，使受控環(huán)境維持在可接受的污染風險水平十分重要[1]。為保證消毒效果，需定期對消毒劑進行效力評估，這也是建立合理消毒規(guī)程的重要依據(jù)。 消毒劑殺滅微生物的效力受到多種因素影響， 如消毒劑的類型、濃度、與微生物的接觸時間以及微生物的種類和生長狀態(tài)等， 這些因素的綜合作用決定了消毒劑的實際殺滅效果。同時， 各種菌株對不同消毒劑的耐受程度都有實際差異，在制定消毒劑管理程序時，應定期使用懸液法確認其有效性[2]。本實驗不僅采用了常規(guī)菌株作為實驗對象， 更創(chuàng)造性地加入了出現(xiàn)頻率較高且長期適應于消殺環(huán)境的分離菌，選取消毒劑常用濃度，并設定不同的作用時間條件， 以探究消毒劑在不同時間下的效果。
Part.01 試驗材料
1.1試劑與培養(yǎng)基
甲酚皂（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號：20221229）；新潔爾滅（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號20220902）；75%乙醇（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號：20221103）；殺孢子劑（濟南辰宇環(huán)保科技有限公司， 批號：20220824）；卵磷脂（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20201216）；吐 溫 80 （國藥集團化學試劑有限公司 ， 批 號 ：20190220）、硫代硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200408），氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20220513）。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：221213）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：230113）；芽孢染色液 （北京陸橋技術(shù)股份有限公司， 批號：230925）。
1.2 設備
HR30-IIA2 型生物安全柜（海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；BF260/KB240 恒溫培養(yǎng)箱（德國 Binder）；SX-700 滅菌器（日本 Tomy）。
1.3測試菌株及來源
用于消毒劑效能驗證測試菌株中的標準菌株（菌種編號：1、9、10、11、12、13、14） 均來自中國食品藥品檢定研究院，環(huán)境菌株來自本實驗室 C 級和 D級區(qū)環(huán)境監(jiān)測時采集的菌株（菌種編號：2、3、4、5、6、7、8）并已經(jīng)過鑒定。
Part.02 方法
2.1 菌液制備
2.1.1 新鮮營養(yǎng)體懸液
取各菌種第 3 代新鮮培養(yǎng)物（24 h），用 0.9%無菌氯化鈉溶液初步制成的菌懸液， 可根據(jù)后續(xù)試驗需要稀釋成所需的濃度。
2.1.2 細菌芽孢懸液
取各菌種第 3 代的新鮮培養(yǎng)物（7 d），當芽孢形成率達到適宜程度后，用 0.9%無菌氯化鈉溶液初步制成的芽孢懸液，于 60℃水浴中保溫 30 min，以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷卻至室溫后，可根據(jù)后續(xù)試驗需要稀釋成所需的濃度。
2.1.3 真菌孢子懸液
取菌種第 3 代的新鮮培養(yǎng)物（7d），在斜面試管內(nèi)加入 5.0 mL 含 0.05%（mL/mL）聚山梨酯 80 的 0.9%的無菌氯化鈉溶液，反復吹吸洗下孢子，轉(zhuǎn)移至滅菌試管中，可根據(jù)后續(xù)試驗需要稀釋成所需的濃度。
2.2 中和劑驗證試驗
選用不同成分的中和劑，對不同消毒劑品種進行中和處理，75%乙醇（0.1%卵磷脂+3%吐溫 80）、甲酚皂（甲酚含量為 3.0%±0.3%，0.1%卵磷脂+3%吐溫80+0.5%硫代硫酸鈉）、新潔爾滅（苯扎溴銨含量為（30±3）g/L，0.1%卵磷脂+1%吐溫 80）、 殺孢子劑（過氧化氫4%~6.5%（W/W），銀離子≤0.01%，1%硫代硫酸鈉）。
將菌懸液用 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成 102~103 CFU/mL，作為實驗菌懸液。 實驗共分 4 組：第 1組：9 mL 中和劑+1 mL 實驗菌懸液→作用 10 min→吸取 1.0 mL 注皿； 第 2 組：1 mL 消毒劑+8 mL 中和劑+1 mL 實 驗 菌 懸 液→作 用 10 min→吸 取 1.0 mL注皿； 第 3 組：9 mL 稀釋液+1 mL 實驗菌懸液→作用 10 min→吸取 1.0 mL 注皿；第 4 組：陰性對照組：吸取 1.0 mL 稀釋液注皿。 每組平皿采用 TSA/SDA傾注法，在 37℃/28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細菌繁殖體培養(yǎng) 48 h，細菌芽孢及真菌需培養(yǎng) 72 h），重復試驗 3 次，活菌計數(shù)后求得每種實驗菌的平均回收率。
2.3 懸液定量殺滅試驗
實驗組： 在 9 mL 消毒劑中加入濃度約為 108CFU/mL 的菌液，分別作用 1、2、5 min，吸取 1 mL 混合液，置于 9 mL 相應的中和劑中，作用 10 min，再吸取 1 mL 上述混合液，經(jīng)適當稀釋后活菌計數(shù)，操作方法同“2.2”。
對照組：用 0.9%無菌氯化鈉溶液代替消毒液進行平行試驗，作為陽性對照。 每組試驗重復 3 次，計算各組的活菌濃度（CFU/mL），并換算為對數(shù)值（N）。
2.4 評價規(guī)定
2.4.1 中和劑驗證試驗組
在達到設定消毒除菌作用時間后， 應立即采用中和劑終止消毒進程以評估消毒除菌效果，參考《中國藥典》2025 年版四部 “藥品微生物實驗室消毒劑效力評估指導原則”草案公示稿，對中和效果應進行驗證。
中和劑的有效性：回收率 1=（第 2 組回收菌數(shù)/第 3 組回收菌數(shù)）×100%，如回收率在 50%~200%范圍內(nèi)，說明中和劑有效。
中和劑的安全性：回收率 2=（第 1 組回收菌數(shù)/第 3 組回收菌數(shù)）×100%， 如回收率在 50%~200%范圍內(nèi)，說明中和劑對挑戰(zhàn)菌株的生長無影響。
2.4.2 懸液定量殺滅試驗組
KL=No-Nx[3]
其中：KL——殺滅對數(shù)值；No——對照組平均活菌濃度對數(shù)值；Nx——實驗組平均活菌濃度對數(shù)值。
2.4.3 評價標準
各國評價標準有所不同， 參考日本藥典及美國藥典的要求， 計算試驗菌在消毒處理前后減少的對數(shù)值：細菌或真菌營養(yǎng)體減少的對數(shù)值不少于 3，細菌芽孢或真菌孢子減少的對數(shù)值不少于 2， 表明消毒劑對試驗菌有效。
Part.03 結(jié)果
3.1中和劑的驗證結(jié)果
結(jié)果表明， 各菌株的回收率均穩(wěn)定在 50%~200%的合理范圍內(nèi)。 具體數(shù)據(jù)詳見表 1~表 4，此濃度的中和劑展現(xiàn)出了良好的中和效果， 能夠有效中和本實驗中所用的消毒劑， 并且不影響菌株的正常生長狀況。
表1 75%乙醇懸液定量殺滅試驗結(jié)果
表2 甲酚皂懸液定量殺滅試驗結(jié)果
表3 新潔爾滅懸液定量殺滅試驗結(jié)果
表4 殺孢子劑懸液定量殺滅試驗結(jié)果
3.2各種消毒劑的懸液定量殺滅試驗結(jié)果
本實驗在活菌計數(shù)中因技術(shù)操作而引起的菌落數(shù)誤差率均未超過 10%[4]。 在不同的作用時間下，各種消毒劑不同菌株的殺滅效力存在著一定的差異，但在延長作用時間后，均得到了較好的殺滅效果，由表 5 所示，可見消毒劑在一定的濃度下，對細菌的作用時間越長，消毒效果也越好[5]。
表5 不同類型消毒劑的懸液定量殺滅試驗結(jié)果比較
Part.04 討論
4.1 消毒劑的選擇
根據(jù)微生物殺滅對象的不同， 消毒劑可分為殺孢子劑和非殺孢子劑（醇類、季銨鹽類、酚類等），由于普通劑能夠?qū)⑽⑸锓敝丑w減少到安全的水平，但不能殺滅孢子， 因此本試驗只在殺孢子劑的測試中增加了黑曲霉。
根據(jù)實驗結(jié)果（表 5）可知，75%乙醇和甲酚皂在正常的作用時間下的殺菌效果稍遜于其他 2 種消毒劑，需要延長作用時間來得到更好的殺滅效果。真菌及芽孢桿菌對各種消毒劑的敏感性均相對較差。在所有被測試的消毒劑中，殺孢子劑對微生物的殺滅效力最強，其主要成分多為過氧化氫或過氧乙酸，它們作為強氧化劑，具有破壞或分解微生物細胞壁的能力，能夠迅速進入細胞內(nèi)，氧化細胞內(nèi)的酶、RNA 和 DNA，從而導致微生物死亡。
4.2 消毒劑的合理應用
根據(jù)微生物殺滅對象的不同， 長期使用同一種消毒劑， 很可能會造成微生物會逐漸產(chǎn)生抗性（即在一般可以殺滅或抑制絕大部分細菌的濃度下，具有消毒劑抗性的菌株則不能被殺滅或抑制[6]），并加劇其抗性基因的傳播風險，從而導致消毒效果降低[7]。 在 2020 版《中國藥典》中，也提到了潔凈區(qū)清潔和消毒的重要性， 由于化學消毒方式有其不可替代性， 因此所使用的消毒劑種類必須多于一種，以防止消毒劑抗性的產(chǎn)生和擴散，從而達到最大限度降低微生物污染的目的[8]。
此外， 根據(jù)真實的環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)評估常用幾種消毒劑的效能也十分必要。統(tǒng)計可知，在藥品生產(chǎn)及檢測環(huán)境中， 葡萄球菌屬及微球菌屬在環(huán)境微生物中占比最高，主要來源于實驗室的操作人員[9]，其次為芽孢桿菌屬。 基于日常環(huán)境監(jiān)測中對菌株的收集與鑒定數(shù)據(jù)，挑選出比較有代表性的菌株（例如細菌繁殖體、芽孢及真菌）用于消毒劑的驗證試驗，便可篩選出高效且適合的消毒劑。
同時，也要充分考慮各消毒劑的應用場景，醇類消毒劑特別適用于對精密設備和儀器的消毒工作，因為其不具有腐蝕性， 不會對不銹鋼和彩鋼板等金屬材質(zhì)產(chǎn)生損害[10]。 而過氧化氫類消毒劑則因其無色無味無毒，對操作人員友好，具有廣譜殺菌能力、高材料兼容性且性能穩(wěn)定， 常用于需要空間消毒的此類場景。 除此之外，對人員、設備和房間的清潔消毒流程可以參考微生物調(diào)查的結(jié)果，優(yōu)化相關(guān)程序，這樣才能確保消毒劑能夠達到預期的效果。
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來源：Internet
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